Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / La venta de biofármacos representa una industria billonaria que ha crecido exponencialmente desde la década de los 70's debido al aumento de la demanda por estas proteínas terapéuticas altamente específicas. Estas proteínas recombinantes son sintetizadas por diferentes líneas celulares, especialmente aquella derivada de ovarios de hámster chino CHO ya que presentan altas tasas específicas de producción de proteína recombinante y son fácilmente adaptables a escalas industriales. Hoy en día, más de la mitad de los anticuerpos monoclonales que se encuentran en el mercado son producidos por células CHO.
Para incrementar el rendimiento de los procesos productivos, diferentes metodologías han sido usadas por investigadores. Resultados positivos han sido obtenidos aplicando principios de ingeniería y utilizando herramientas de biología molecular para modificar reacciones bioquímicas. Proyectos de Ingeniería Metabólica han sido exitosos en reducir la producción de metabolitos indeseados, especialmente lactato, e incrementar la síntesis de proteína recombinante. En este trabajo se estudia el efecto que tienen diferentes estrategias de Ingeniería Metabólica sobre el metabolismo y cultivo de células CHO.
Se ha probado que el metabolismo de carbono de células CHO es altamente ineficiente, consumiendo una cantidad de glucosa mayor de la necesaria para mantener el metabolismo energético y proliferación celular. En este trabajo se construyeron clones de células CHO productoras de IgG recombinante que sobre-expresan PYC2, MDH II y trasportador de fructosa. La expresión de estos genes permitiría aliviar cuellos de botella en el metabolismo central del carbono de las células. En este trabajo se estudiaron y contrastaron los efectos de la sobre-expresión de estos genes sobre la extensión de los cultivos, metabolismo y productividad. Los resultados indican que todos los clones estudiados presentan un metabolismo más eficiente, caracterizado por una menor producción de lactato por glucosa consumida y que no todos mejoraron su proliferación celular y/o productividad específica. Células CHO sobre expresando PYC2 mejoraron su tasa máxima de crecimiento, pero redujeron la tasa de producción de proteína recombinante; la sobre-expresión de MDH II conduce a la reducción del crecimiento celular y síntesis de proteína; finalmente, sobre-expresar el transportador de fructosa aumenta la proliferación celular y síntesis de proteína recombinante en medios con fructosa. Proponemos que las diferencias en producción de proteína se deben a alteraciones del estado RedOx de la célula que afectan en ensamblado de las cadenas peptídicas y la secreción de éstas.
Reducir la expresión del gen Lactato deshidrogenasa A ha sido el objetivo de numerosos trabajos con el fin de reducir la síntesis de lactato e incrementar la producción de proteína recombinante. Utilizando el nuevo sistema para edición genómica CRISPR-Cas logramos interrumpir una de las copias del gen. Resultados del análisis de cultivos fed-batch de estas células indican que el crecimiento celular y el metabolismo fueron afectados y la síntesis específica y volumétrica de la proteína recombinante incrementó considerablemente.
Se realizó un análisis a profundidad del metabolismo de las células deficientes en LDHa. Se midió la razón NAD+/NADH de éstas y el valor indicó que las células mutadas presentan niveles de NAD +/NADH menores que las del cultivo control, sugiriendo una mejora en su metabolismo energético debido a la mayor acumulación de NADH. Mediante Análisis de Flujos Metabólicos se estimó los flujos entre las reacciones más importantes del metabolismo central de las células. Los resultados confirmaron que en las células mutantes existen mayores flujos en el ciclo del TCA, debido principalmente a un mayor aporte de carbonos provenientes del catabolismo de amino ácidos. Estas células también presentan un menor flujo en la vía de la glicólisis, lo que se correlaciona con la menor proliferación que estas presentaron, y esto último puede explicar el aumento de síntesis de proteínas.
En este trabajo se aplicaron exitosamente conceptos de Ingeniería Metabólica para la construcción de
clones con distintos metabolismos. Este trabajo revela los efectos de varias modificaciones, lo que lo hace una
fuente útil información acerca de los efectos que tienen variadas estrategias metabólicas sobre cultivos de
células CHO. Finalmente, este trabajo resulta ser un aporte para la comunidad científica contribuyendo con la
primera comparación de diferentes clones que sobre-expresan genes claves del metabolismo central del
carbono y entregando el primer estudio en profundidad del efecto de reducir la expresión del gen de la LDHa.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/132337 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Wilkens Díaz-Muñoz, Camila |
| Contributors | Gerdtzen Hakim, Ziomara, Facultad de Ciencias Físicas y Matemáticas, Departamento de Ingeniería Química y Biotecnología, Altamirano Gómez, Claudia, Andrews Farrow, Bárbara, Asenjo de Leuze, Juan, Salazar Aguirre, María Oriana |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Atribución-NoComercial-SinDerivadas 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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