Η ακρίβεια και η πιστότητα της διαδικασίας διπλασιασμού του γονιδιώματος είναι μείζωνος σημασίας για την κυτταρική επιβίωση. Τυχόν ανωμαλίες όπως μεταλλάξεις ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην εμφάνιση κακοήθειας ή σε πρόωρο κυτταρικό θάνατο.
Τα παραπάνω συνηγορούν στη μεγάλη σημασία που έχει η άρτια λειτουργία και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Δύο πρωτεϊνες, οι geminin και cdt1, κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Πιο συγκεκριμένα, η cdt1 αποτελεί έναν βασικό παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής. Δρα συνεργατικά με την πρωτεϊνη Cdc6 προκειμένου να γίνει η πρόσδεση του εξαμερούς συμπλόκου MCM2-7 στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-RC), διασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτό τις απαραίτητες συνθήκες για τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής (Maiorano D. et al., 2000). Η geminin συνιστά τον φυσικό αναστολέα της cdt1 στα μετάζωα. Προσδένεται ισχυρά στην τελευταία μετά την έναρξη της σύνθεσης του DNA, παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την επαναπρόσδεσή της στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000).
Η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής παρουσιάζει ανωμαλίες σε περιπτώσεις καρκινικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, έχει δειχθεί σταθερή υπερέκφραση της cdt1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, τόσο σε πρωτεϊνικό όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο (Xouri G. et al., 2004). Παρομοίως, αυξημένη έκφραση της cdt1 έχει παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και πρώιμου καρκίνου του πνεύμονα, στον άνθρωπο (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Τα παραπάνω αποτελέσματα έχουν προκύψει κατόπιν μελέτης, η οποία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας. Αναφορικά με τη geminin, αυξημένα επίπεδα έκφρασής της έχουν συσχετιστεί με καρκινώματα παχέος εντέρου καθώς και με τη διαίρεση κακοηθών κυττάρων, γενικότερα (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Επιπροσθέτως, η geminin βρίσκει εφαρμογή ως ανεξάρτητος δείκτης σε περιπτώσεις επιθετικού καρκίνου του μαστού (Gonzalez M.A. et al., 2004).
Βασιζόμενοι στα παραπάνω, θεωρούμε ότι το σύμπλοκο geminin-cdt1 συνιστά έναν ιδανικό στόχο για το σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Το πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία να έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Ενδεχόμενη εύρεση τέτοιων συνθετικών συστατικών καθώς και μετέπειτα φυσικοχημική βελτιστοποίησή τους είναι δυνατόν να οδηγήσει στη δημιουργία ενός νέου αντικαρκινικού φαρμάκου.
Η ολοκλήρωση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος συνέβαλε στην ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνικών μορίων στόχων, τα οποία εμπλέκονται στο μοριακό μηχανισμό διαφόρων ασθενειών. Με βάση τις εξελίξεις των τελευταίων χρόνων στον τομέα της φαρμακοβιομηχανίας, η αξιοποίηση αυτής της γνώσης συνδέεται με το μαζικό έλεγχο συνθετικών συστατικών έναντι αυτών των μορίων στόχων. Απώτερο στόχο αποτελεί η αναγνώριση κατάλληλων συνθετικών συστατικών τα οποία θα έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το μόριο-στόχος και κατ’επέκταση να μεταβάλλουν τον τρόπο λειτουργίας του, προκειμένου να έχουμε το επιθυμητό φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Αποφασιστικής σημασίας στην παραπάνω διαδικασία, αποτελεί η σωστή επιλογή της κατάλληλης μεθόδου μαζικού ελέγχου των νέων υποψήφιων φαρμάκων – συνθετικών συστατικών – έναντι του μορίου στόχου. Στην παρούσα διπλωματική, επιλέχθηκε προς εφαρμογή η μέθοδος FRET. Ένα από τα βασικά της πλεονεκτήματα είναι η υψηλή αναλογία ‘σήματος-θορύβου’ που εμφανίζει καθώς και η υψηλή ποιότητα των δεδομένων που παρέχει. Αν και αποτελεί μία σχετικά καινούρια τεχνική, εντούτοις αποτελεί μία από τις πιο βασικές μεθόδους της σύγχρονης φαρμακοβιομηχανίας λόγω της αξιοπιστίας που την χαρακτηρίζει και επιπλέον της συμβατότητάς της με αυτοματοποιημένες τεχνικές.
Ασφαλώς, απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου αποτελεί η απομόνωση της υπό μελέτη πρωτεϊνης. Η έκφραση του πρωτεϊνικού συμπλόκου geminin-cdt1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βακτηριακών συστημάτων έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Επίσης, ο καθαρισμός του συμπλόκου υπήρξε επιτυχής και βασίστηκε στην εφαρμογή των τεχνικών της χρωματογραφίας συγγένειας και της χρωματογραφίας διήθησης σε πηκτή. Το επόμενο βήμα ήταν να διαπιστώσουμε εάν η μέθοδος FRET καθιστά δυνατή την ανίχνευση σχηματισμού του συμπλόκου. Πράγματι, κάτι τέτοιο ήταν εφικτό καθώς σε συγκέντρωση 60-80nM του συμπλόκου, παρατηρήθηκε αύξηση του σήματος σχεδόν κατά πέντε φορές υψηλότερα από το επίπεδο “θορύβου”. Το αποτέλεσμα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό καθώς συνεπάγεται ότι με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι εφικτός ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Οι λόγοι που συντελούν στην καταλληλότητα της μεθόδου για αυτό το σκοπό έγκεινται αφενός στην ευαισθησία την οποία εμφανίζει (αύξηση του σήματος μέχρι και πέντε φορές) και αφετέρου στην ειδικότητα και την αξιοπιστία της, όπως έχει δειχθεί και με τα αντίστοιχα πειράματα. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα αποτελεί και η μικρή σχετικά ποσότητα πρωτεϊνης (60-80nM), η οποία απαιτείται.
Σύμφωνα με τα δεδομένα που έχουν προκύψει από την παρούσα διπλωματική , το FRET assay συνιστά μία ιδανική μέθοδο για την πραγματοποίηση μαζικού ελέγχου συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου geminin-cdt1. Δεδομένης της πολύ ισχυρής αλληλεπίδρασης του συγκεκριμένου συμπλόκου, πραγματοποιήθηκαν μεταλλαγές σε τρία υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα της cdt1, τα οποία κατέχουν κυρίαρχο ρόλο στην αλληλεπίδραση με τη geminin, σύμφωνα με κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Lee C. et al., 2004). Οι μεταλλαγές αυτές ενδέχεται να συμβάλλουν σε ένα πολύ πιο εύκολα διασπάσιμο σύμπλοκο, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην ευκολότερη και γρηγορότερη ταυτοποίηση υποψήφιων συνθετικών συστατικών. / The accurate and timely duplication of the genome is vital for cell survival. Mutations rearrangements or loss of chromosomes can be detrimental to a single cell as well as to the whole organism, causing malignant cell growth or death.
Origins of replication are licensed by a multi-subunit complex (pre-replicative complex: pre-RC) during G1 (Lei M & Tye B.K., 2001). Pre-RC assembly is an ordered, sequential process in which the Origin Recognition Complex (ORC) first binds to each replication origin and then recruits two other proteins: Cdc6 and Cdt1 (Bell S.P. & Dutta A., 2002). These two proteins function synergistically to load the six mini-chromosome maintenance helicase proteins (MCM2-7) onto the pre-RC, establishing the conditions for DNA licensing (Maiorano D. et al., 2000). The prevention of ectopically induced re-replication is accomplished by functionally redundant mechanisms, including sequestration of MCM by Crm1 (Yamaguchi R. & Newport J., 2003), inactivation and export from the nucleus of Cdc6 (Delmolino L.M. et al., 2001; Jiang W. et al., 1999; Pelizon C. et al., 2000) and degradation of Cdt1 (Nishitani H. et al., 2001). Metazoans, have evolved an additional system for preventing re-replication: Geminin, which was originally identified in Xenopus as essential factor to exit from mitosis (McGarry T.J. & Kirschner M.W., 1998), binds tightly to Cdt1 and prevents Cdt1 assembly onto pre-RC (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000).
Licensing system members are misregulated in cancer cells and differential expression of licensing components could be used for the diagnosis and prognosis of cancer (Shreeram S. & Blow J.J., 2003). Over-expression of Cdt1 can predispose cells to a malignant transformation. It has been shown that Cdt1 is consistently over-expressed in cancer cell lines at both the protein and RNA level (Xouri G. et al., 2004). Moreover, Cdt1 protein is highly expressed in cases of human colon cancer and primary human lung carcinomas (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Similarly, Geminin is also over-expressed in colon carcinomas and its expression levels were directly related to the cellular proliferation index in proliferating malignant cells (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Furthermore, expression of Geminin is considered as an independent indicator of adverse prognosis in cases of invasive breast cancer (Gonzalez M.A. et al., 2004).
Given the crucial role of the Geminin-Cdt1 complex in cell cycle regulation and cancer, this complex could serve as target for the discovery and development of novel anti-cancer drugs. This requires the screening of compounds that are capable of disrupting the geminin-cdt1 complex. For that purpose we performed a HTP (high-throughput)-compatible assay, called FRET-assay. The acronym FRET stands for Fluorescence Resonance Energy transfer. The principle of the assay is based on the radiationless transfer of energy from an excited donor fluorophore (Europium Cryptate) to a suitable acceptor fluorophore (XL665).
The first step was the expression and purification of the geminin-cdt1 complex. The complex was expressed by using E. coli bacterial cells and purified by metal affinity chromatography on a Ni+2 column. As soon as the complex was ready to use, we next tried to investigate whether the formation of the complex was detectable by using the FRET assay. Indeed, at the complex concentration of 60nM and 80nM, the signal was about 5 times above background. This was a first indication that the Geminin-Cdt1 complex can be used successfully for energy transfer based assays.
Given the very high binding affinity of the two proteins (Lee C. et al., 2004), it could be quite unlikely to find a compound that can disrupt the complex. To overcome that obstacle, three single mutations were made at the highly conserved Geminin-contacting residues of hCdt1, Y170, F173 and L176. The mutation of these residues to alanine can possibly provide a more easily disruptable complex, which could be of importance concerning the faster and easier identification of any candidate compounds.
Our data suggest that hGeminin-Cdt1 complex can be considered as a promising target for compound screening. Given the high importance of Geminin-Cdt1 balance for maintaining genomic stability integrity and that both proteins have been correlated with cases of cancer, that screening could hopefully lead to the discovery and development of lead compounds towards anti-cancer drugs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/1202 |
| Date | 22 December 2008 |
| Creators | Καραντζέλης, Νικόλαος |
| Contributors | Ταραβήρας, Σταύρος, Ταραβήρας, Σταύρος, Φλωρδέλλης, Χριστόδουλος, Λυγερού, Ζωή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0116 seconds