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Desenvolvimento da PCR em Tempo Real para.pdf: 2139383 bytes, checksum: 1075a6c994ede19cfbf82267ae9a76b9 (MD5)
Previous issue date: 2010 / CNPq e FAPESP / Fundação Oswaldo Cruz. Pavilhão Hélio Peggy e Pereira. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia duodenalis (G. duodenalis) é um protozoário entérico patogênico distribuído
mundialmente e apresenta amplo espectro de hospedeiros mamíferos, incluindo
humanos. Isolados deste parasito possuem grande diversidade genética,
apresentando sete genótipos (A-G) e diversos subtipos. No entanto, apenas os
genótipos A e B infectam o homem e no subtipo A1 concentra-se o potencial
zoonótico do parasito. Análise das sequências de amplicons de determinados
marcadores moleculares demonstrou resultados discordantes na genotipagem de G.
duodenalis evidenciando a necessidade de identificar novos marcadores. A proposta
desse trabalho foi avaliar a aplicabilidade do locus da enzima málica (ME)
comparando os resultados obtidos com o gene da β-giardina (βg) usando a PCR
convencional seguida de sequenciamento para detecção e genotipagem de
amostras clínicas. Foi desenvolvida uma PCR em Tempo Real - ME para detectar,
quantificar e genotipar isolados de G. duodenalis diretamente de amostras de fezes.
Foram usadas 100 amostras clínicas (83 humanas e 17 caninas) positivas segundo
exame parasitológico e imunológico.
A N - PCR convencional - βg amplificou 61%
destas (52 amostras humanas e sete caninas) e todas foram caracterizadas como
genótipo A, sendo 42 subtipo A1 (38 humanas e quatro caninas) e 19 subtipo A2 (16
humanos e três caninas). A N - PCR convencional - ME detectou apenas nove
amostras (9%) positivas e todas pertencentes ao genótipo A, sendo seis humanas
(quatro pertencentes ao subtipo A1, uma subtipo A2 e uma com subtipo
indeterminado) e três caninas (todas A1). Ao correlacionar a genotipagem por
ambos marcadores, observou-se concordância na identificação do genótipo. A
comparação do limite de detecção da PCR convencional ME com a PCR em Tempo
Real - ME demonstrou que esta última foi aproximadamente 10 4 vezes mais
sensível. Análise estatística dos resultados obtidos com as réplicas da curva-padrão
indicou reprodutibilidade do método e determinou que amostras negativas são
aquelas com valores de Ct > 37. Desta forma, 71 amostras clínicas (71%) foram
positivas na PCR em Tempo Real - ME com sonda para subtipo A1, destas 62
(87,3%) eram amostras humanas e nove (13,4%) caninas. A quantificação relativa
de DNA de G. duodenalis nas amostras clínicas com a PCR em Tempo Real - ME,
demonstrou que a concentração de cistos nas amostras analisadas variou de 4,21
ng a 204 fg (respectivamente, 22.000 e 1,0 cistos). A PCR em Tempo Real - ME
apresentou maior sensibilidade em relação à N - PCR convencional - ME, indicando
a necessidade de utilização de novos iniciadores, pois os utilizados encontram-se
em regiões polimórficas, como demonstrado pela análise das sequências de ME.
Apesar da necessidade de mais estudos, os resultados obtidos neste trabalho
indicam que a PCR em Tempo Real - ME possui potencial aplicabilidade nos
estudos de epidemiologia molecular da giardíase. / Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite found
worldwide in various mammalian hosts, including humans. G. duodenalis isolates
display high genetic diversity with seven genotypes (A-G) and subtypes. However,
only A and B assemblages have been detected in humans. The subtype A1 parasite
presents the strongest zoonotic potential. Discordant genotyping and detection
results of G. duodenalis isolates have been previously reported using amplicon
sequence analysis from certain molecular markers. Therefore, this leads to the
search of novel ones. The purpose of this work was to compare conventional PCR,
followed by sequencing, using malic enzyme (ME) and β-giardin gene (βg) as
molecular markers for the detection and genotyping of the parasite found in faecal
samples. Likewise, an approach involving Real Time PCR - ME for detecting,
quantifying and genotyping G. duodenalis isolates was developed. We collected 100
positive faecal samples (83 humans and 17 canines) according to parasitological
exam and immunoassays. N - PCR - βg detected 61 positive samples (61%) from
which 52 were human and seven were canine. All those samples were characterized
as genotype A. Subtype A1 and A2 were determined in 42 (38 humans/4 canines)
and 19 (16 humans/3 canines) samples, respectively. However N - PCR - ME
analyses revealed that only nine faecal samples (9%) were positive (6 humans/3
canines) for genotype A. Six human samples were subtyped as A1 (4), A2 (1) and
one not-determined, and the three canine samples were subtype A2. However, when
correlating the sample genotyping using both markers, we have observed an
agreement in the identification of the genotypes. The comparison of the detection
limit between the N - PCR - ME and the Real Time PCR - ME showed that the latter
one was approximately 104-fold more sensitive. The statistical analysis of the data
from the standard curve replicates indicated reproducibility of the method.
Furthermore, Ct values > 37 were established as an indicative for negative samples.
Therefore, Real Time PCR - ME analysis revealed that 71 samples (71%) were
positive for subtype A1 from which 62 (87.3%) and nine (13.4%) samples were
humans and canines, respectively. The relative quantification of G. duodenalis DNA
in the clinical samples using Real Time PCR - ME varied from 4.21 ng to 204.0 fg
corresponding to 22.000 and one cyst, respectively. Overall, Real Time PCR – ME
analysis showed to be more sensitive than N - PCR - ME. It, thus, suggest the need
to design different primers, because the ones used were within a polymorphic region
of the ME sequence. Although more investigation is yet to be done, the results
achieved in this work indicate that Real Time PCR - ME has a great potential in the
applicability for molecular epidemiological studies of giardiasis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4172 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Ramos, Nathália Motta Delvaux |
| Contributors | Junqueira, Angela Cristina Veríssimo, Brazil, Reginaldo Peçanha, Peralta, Jose Mauro, Barreto, Rubem Figueiredo Sadok Menna, Gadelha, Ana Paula Rocha, Fernandes, Octavio |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Nathália Motta Delvaux Ramos, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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