GOMES, Isabele Bessera Santos. Avaliação dos parâmetros hematológicos e bioquímicos de voluntários sadios da Unidade de Farmacologia Clínica da UFC. 2005. 114 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2003. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-04-04T16:07:37Z No. of bitstreams: 1 2005_dis_ibsgomes.pdf: 550207 bytes, checksum: 80d50cef05f47a73fa217f55f771e3cf (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-04-09T16:03:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2005_dis_ibsgomes.pdf: 550207 bytes, checksum: 80d50cef05f47a73fa217f55f771e3cf (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-09T16:03:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2005_dis_ibsgomes.pdf: 550207 bytes, checksum: 80d50cef05f47a73fa217f55f771e3cf (MD5) Previous issue date: 2005 / The values of reference of laboratorial parameters are defined on the basis of statistical criteria for a random sample of individuals. The published parameters of reference are proceeding from a variety of samples, including blood donors, participants of job admission examinations and normal voluntaries that are submitted to routine examinations for clinical assays. This research is of the documentary type with quantitative approach. The sample was constituted by 1.947 laboratorial parameters of healthy volunteers, of both genders, with average of 25 years, which had participated of clinical assays in the Clinical Pharmacological Unit (UNIFAC – UFC), between the years of 1999 and 2003. For the accomplishment of the study, the following information had been obtained from case report files: identification of the volunteer, besides the hematological and biochemical parameters. Seventy five clinical assays have been investigated. The results demonstrated statistical differences between the genders, for the majority of the analyzed parameters. The normal reference intervals have been calculated by the method of percentiles, being found the following values for the hematological analysis for women and men, respectively: erytrocytes – from 3.9 to 5.0 millions/mm3 and from 4.4 to 5.7 millions/mm3; hemoglobin – from 14.8 to 15.3 g/dL, and from 13.6 to 16.9 g/dL; leukocytes – between 4.400 and 10.500/mm3, and between 4.200 and 10.100//mm3; platelets – from 165.000 to 397.000/mm3, and from 155.600 to 354.400/mm3. For the biochemical parameters, there were found the following values for women and men, respectively: creatinine – from 0.5 to 0.9 mg/dL, and from 0.7 to 1.2 mg/dL; glucose – between 69 and 96 mg/dL, and between 71 and 100 mg/dL; cholesterol – between 118 and 224 mg/dL, and between 112 and 219 mg/dL; triglycerides – from 38 to 171 mg/dL, and from 42 to 197 mg/dL. Our findings suggest that the reference values of investigated parameters, for the metropolitan population of Fortaleza, must be redefined as that enclosed in the interval between the 2.5 and 97, which correspond to 95% of the total distribution of the values of each parameter. / Os valores de referência de exames laboratoriais são definidos com base em critérios estatísticos para uma amostra aleatória de indivíduos. Os parâmetros de referência publicados são provenientes de uma variedade de amostras, incluindo doadores de sangue, participantes de exames admissionais e voluntários normais que fazem exames de rotina para ensaios clínicos. Esta pesquisa é do tipo documental com abordagem quantitativa. A amostra foi constituída por 1.947 exames laboratoriais dos voluntários sadios, de ambos os sexos, com idade média de 25 anos, que participaram de ensaios clínicos na UNIFAC, entre os anos de 1999 e 2003. Para a realização do estudo, foram colhidos dos prontuários as seguintes informações: dados de identificação do voluntário, além dos parâmetros hematológicos e bioquímicos. Foram investigados setenta e cinco ensaios clínicos, tendo os resultados demonstrado diferença estatística entre os sexo, para a maioria dos parâmetros analisados. As faixas de referência foram calculadas pelo método dos percentis, sendo encontrado os seguintes valores para a análise hematológica para mulheres e homens, respectivamente: eritrócitos - de 3,9 a 5,0 milhões/mm3 e 4,4 a 5,7 milhões/mm3; hemoglobina - de 14,8 a 15,3 g/dL e 13,6 a 16,9 g/dL; leucócitos - de 4.400 a 10.500/ mm3 e 4.200 a 10.100/mm3; plaquetas – de 165.000 a 397.000/ mm3 e 155600 a 354400/ mm3. Já para os parâmetros bioquímicos, verificaram-se os seguintes valores para mulheres e homens, respectivamente: creatinina - de 0,5 a 0,9 mg/dL e 0,7 a 1,2 mg/dL; glicose - de 69 a 96 mg/dL e 71 a 100 mg/dL; colesterol - de 118 a 224 mg/dL e 112 a 219 mg/dL; triglicerídeos - de 38,0 a 171 mg/dL e 42 a 197 mg/dL. Os nossos achados sugerem que os valores de referência dos parâmetros investigados, para a população metropolitana de Fortaleza, sejam redefinidos como aqueles incluídos no intervalo entre os percentis 2,5o e 97o, os quais correspondem a 95% da distribuição total dos valores de cada parâmetro.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-17T17:10:52Z No. of bitstreams: 1 Desenvolvimento da PCR em Tempo Real para.pdf: 2139383 bytes, checksum: 1075a6c994ede19cfbf82267ae9a76b9 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-17T17:10:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Desenvolvimento da PCR em Tempo Real para.pdf: 2139383 bytes, checksum: 1075a6c994ede19cfbf82267ae9a76b9 (MD5) Previous issue date: 2010 / CNPq e FAPESP / Fundação Oswaldo Cruz. Pavilhão Hélio Peggy e Pereira. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Giardia duodenalis (G. duodenalis) é um protozoário entérico patogênico distribuído mundialmente e apresenta amplo espectro de hospedeiros mamíferos, incluindo humanos. Isolados deste parasito possuem grande diversidade genética, apresentando sete genótipos (A-G) e diversos subtipos. No entanto, apenas os genótipos A e B infectam o homem e no subtipo A1 concentra-se o potencial zoonótico do parasito. Análise das sequências de amplicons de determinados marcadores moleculares demonstrou resultados discordantes na genotipagem de G. duodenalis evidenciando a necessidade de identificar novos marcadores. A proposta desse trabalho foi avaliar a aplicabilidade do locus da enzima málica (ME) comparando os resultados obtidos com o gene da β-giardina (βg) usando a PCR convencional seguida de sequenciamento para detecção e genotipagem de amostras clínicas. Foi desenvolvida uma PCR em Tempo Real - ME para detectar, quantificar e genotipar isolados de G. duodenalis diretamente de amostras de fezes. Foram usadas 100 amostras clínicas (83 humanas e 17 caninas) positivas segundo exame parasitológico e imunológico. A N - PCR convencional - βg amplificou 61% destas (52 amostras humanas e sete caninas) e todas foram caracterizadas como genótipo A, sendo 42 subtipo A1 (38 humanas e quatro caninas) e 19 subtipo A2 (16 humanos e três caninas). A N - PCR convencional - ME detectou apenas nove amostras (9%) positivas e todas pertencentes ao genótipo A, sendo seis humanas (quatro pertencentes ao subtipo A1, uma subtipo A2 e uma com subtipo indeterminado) e três caninas (todas A1). Ao correlacionar a genotipagem por ambos marcadores, observou-se concordância na identificação do genótipo. A comparação do limite de detecção da PCR convencional ME com a PCR em Tempo Real - ME demonstrou que esta última foi aproximadamente 10 4 vezes mais sensível. Análise estatística dos resultados obtidos com as réplicas da curva-padrão indicou reprodutibilidade do método e determinou que amostras negativas são aquelas com valores de Ct > 37. Desta forma, 71 amostras clínicas (71%) foram positivas na PCR em Tempo Real - ME com sonda para subtipo A1, destas 62 (87,3%) eram amostras humanas e nove (13,4%) caninas. A quantificação relativa de DNA de G. duodenalis nas amostras clínicas com a PCR em Tempo Real - ME, demonstrou que a concentração de cistos nas amostras analisadas variou de 4,21 ng a 204 fg (respectivamente, 22.000 e 1,0 cistos). A PCR em Tempo Real - ME apresentou maior sensibilidade em relação à N - PCR convencional - ME, indicando a necessidade de utilização de novos iniciadores, pois os utilizados encontram-se em regiões polimórficas, como demonstrado pela análise das sequências de ME. Apesar da necessidade de mais estudos, os resultados obtidos neste trabalho indicam que a PCR em Tempo Real - ME possui potencial aplicabilidade nos estudos de epidemiologia molecular da giardíase. / Giardia duodenalis (G. duodenalis) is an intestinal protozoan parasite found worldwide in various mammalian hosts, including humans. G. duodenalis isolates display high genetic diversity with seven genotypes (A-G) and subtypes. However, only A and B assemblages have been detected in humans. The subtype A1 parasite presents the strongest zoonotic potential. Discordant genotyping and detection results of G. duodenalis isolates have been previously reported using amplicon sequence analysis from certain molecular markers. Therefore, this leads to the search of novel ones. The purpose of this work was to compare conventional PCR, followed by sequencing, using malic enzyme (ME) and β-giardin gene (βg) as molecular markers for the detection and genotyping of the parasite found in faecal samples. Likewise, an approach involving Real Time PCR - ME for detecting, quantifying and genotyping G. duodenalis isolates was developed. We collected 100 positive faecal samples (83 humans and 17 canines) according to parasitological exam and immunoassays. N - PCR - βg detected 61 positive samples (61%) from which 52 were human and seven were canine. All those samples were characterized as genotype A. Subtype A1 and A2 were determined in 42 (38 humans/4 canines) and 19 (16 humans/3 canines) samples, respectively. However N - PCR - ME analyses revealed that only nine faecal samples (9%) were positive (6 humans/3 canines) for genotype A. Six human samples were subtyped as A1 (4), A2 (1) and one not-determined, and the three canine samples were subtype A2. However, when correlating the sample genotyping using both markers, we have observed an agreement in the identification of the genotypes. The comparison of the detection limit between the N - PCR - ME and the Real Time PCR - ME showed that the latter one was approximately 104-fold more sensitive. The statistical analysis of the data from the standard curve replicates indicated reproducibility of the method. Furthermore, Ct values > 37 were established as an indicative for negative samples. Therefore, Real Time PCR - ME analysis revealed that 71 samples (71%) were positive for subtype A1 from which 62 (87.3%) and nine (13.4%) samples were humans and canines, respectively. The relative quantification of G. duodenalis DNA in the clinical samples using Real Time PCR - ME varied from 4.21 ng to 204.0 fg corresponding to 22.000 and one cyst, respectively. Overall, Real Time PCR – ME analysis showed to be more sensitive than N - PCR - ME. It, thus, suggest the need to design different primers, because the ones used were within a polymorphic region of the ME sequence. Although more investigation is yet to be done, the results achieved in this work indicate that Real Time PCR - ME has a great potential in the applicability for molecular epidemiological studies of giardiasis.

O objetivo desse trabalho foi construir o fago recombinante D29::gfp e testar a sua utilização como um agente revelador da viabilidade bacilar na determinação da concentração inibitória mínima (GIM) aos principais fármacos administrados no tratamento da tuberculose. O fago recombinante contém o promotor hsp70 e o gene da proteína verde fluorescente (gfp) e foi construído através da restrição pela Spe I em uma região intergênica próxima a extremidade coesiva direita no genoma do fago D29. O promotor hsp70 e gfp clonados no pYL GFP foram amplificados pela PCR utilizando iniciadores com sítios para Spe I. O DNA do fago D29 digerido pela Spe I foi ligado com o fragmento hsp 70- gfp empregando a T 4 DNA ligase e os produtos da reação de ligação foram transformados de acordo com o protocolo de encapsulamento. A infecção do M.smegmatis com esse fago recombinante induziu a expressão da proteína verde fluorescente (GFP). Para avaliar o uso do fago recombinante em teste de sensibilidade aos fármacos anti-tuberculose, 100 isolados clínicos foram testados quanto ao perfil de sensibilidade a isoniazida (H), rifampicina (R), estreptomicina (S) e etambutol (E), utilizando o método das proporções em Lowenstein-Jensen (L-J), técnica em microplaca com a resazurina (REMA) e técnica em microplaca com D29::gfp. Os resultados do REMA demonstraram que 30 isolados clínicos foram sensíveis à H e 58 (66 %) isolados clínicos foram resistentes, dentre os quais a CIM foi 1 µg/mL ou maior para 41 (71 %). A CIM da R para 49 (56%) dos isolados clínicos resistentes foi de 0,5 µg/mL para 17 (35%). A CIM da S para 33 (37%) dos isolados clínicos resistentes foi de 2 µg/mL para 13 (40%) e CIM do E para 34 (39%) dos isolados clínicos resistentes foi de 16 µg/mL ou maior para 19 (56%). A caracterização molecular pela PCR IS6110 identificou 88 isolados clínicos como M.tuberculosis e pelo PRA hsp65, sete isolados clínicos foram M.kansasii, quatro foram M.abscessus e um M.szulgai. Após empregar o fago recombinante como um agente indicador da viabilidade bacilar para testar a atividade dos fármacos anti-tuberculose conclui-se que a expressão da proteína verde fluorescente foi inespecífica e não reprodutiva, não justificando o seu uso para determinar a CIM para os principais fármacos administrados no tratamento da tuberculose. / The objective of this work was to construct the recombinant phage D29::gfp and to use this phage as an indicator agent of cell viability in a minimal inhibitory concentration (MIC) assay for the mains drugs used for tuberculosis treatment. The recombinant phage contains the mycobacteria-specific hsp70 promoter controlling the green fluorescent protein gene (gfp) and was constructed by Spe I restriction in the intergenic region next to the right cohesive termini of the D29 phage genome. An hsp 70 promoter and gfp previously cloned in p YL GFP was amplified by PCR using primers with Spe I sites. The Spe I-restricted D29 phage DNA was ligated with the hsp 70-gfp fragment using T4 DNA ligase and ligated product was transformed using the packing protocol. Infection of M.smegmatis with this recombinant phage indicated the expression of green f1uorescent protein (GFP). To use the recombinant phage for assaying the activity of anti-TB drugs, 100 clinical isolates was tested for susceptibility to isoniazid (H), rifampicin (R), streptomycin (S), and ethambutol (E) using both the proportion method on Lowenstein-Jensen (L-J) medium, resazurin microtiter assay plate (REMA), as well as a microplate assay using D29::gfp. The REMA plate method showed that 30 clinical isolates were susceptible to H and 58 (66%) clinical isolates were resistant, where the MICs were 1 µg/mL or higher for 41 (71%). The R MICs for 49 (56%) resistant clinical isolates were 0,5 µg/mL for 17 (35%). The S MICs for 33 (37%) resistant clinical isolates were 2 µg/mL for 13 (40%) and E MICs for 34 (39%) resistant clinical isolates were 16 µg/mL or higher for 19 (56%). Molecular characterization by PCR IS6110 showed that 88 clinical isolates were M.tuberculosis and by PRA hsp65 were seven clinical isolates were M.kansasii and four was M.abscessus, and one M.zulgai. After using the recombinant phage as an indicator agent of cell viability for assaying the activitity of anti-TB drugs we can conclude that the expression of green fluorescent protein was non-specific and not reproducible, rendering it not useful for the determination of the MIC of the principal drugs used for the treatment of tb.

O objetivo desse trabalho foi construir o fago recombinante D29::gfp e testar a sua utilização como um agente revelador da viabilidade bacilar na determinação da concentração inibitória mínima (GIM) aos principais fármacos administrados no tratamento da tuberculose. O fago recombinante contém o promotor hsp70 e o gene da proteína verde fluorescente (gfp) e foi construído através da restrição pela Spe I em uma região intergênica próxima a extremidade coesiva direita no genoma do fago D29. O promotor hsp70 e gfp clonados no pYL GFP foram amplificados pela PCR utilizando iniciadores com sítios para Spe I. O DNA do fago D29 digerido pela Spe I foi ligado com o fragmento hsp 70- gfp empregando a T 4 DNA ligase e os produtos da reação de ligação foram transformados de acordo com o protocolo de encapsulamento. A infecção do M.smegmatis com esse fago recombinante induziu a expressão da proteína verde fluorescente (GFP). Para avaliar o uso do fago recombinante em teste de sensibilidade aos fármacos anti-tuberculose, 100 isolados clínicos foram testados quanto ao perfil de sensibilidade a isoniazida (H), rifampicina (R), estreptomicina (S) e etambutol (E), utilizando o método das proporções em Lowenstein-Jensen (L-J), técnica em microplaca com a resazurina (REMA) e técnica em microplaca com D29::gfp. Os resultados do REMA demonstraram que 30 isolados clínicos foram sensíveis à H e 58 (66 %) isolados clínicos foram resistentes, dentre os quais a CIM foi 1 µg/mL ou maior para 41 (71 %). A CIM da R para 49 (56%) dos isolados clínicos resistentes foi de 0,5 µg/mL para 17 (35%). A CIM da S para 33 (37%) dos isolados clínicos resistentes foi de 2 µg/mL para 13 (40%) e CIM do E para 34 (39%) dos isolados clínicos resistentes foi de 16 µg/mL ou maior para 19 (56%). A caracterização molecular pela PCR IS6110 identificou 88 isolados clínicos como M.tuberculosis e pelo PRA hsp65, sete isolados clínicos foram M.kansasii, quatro foram M.abscessus e um M.szulgai. Após empregar o fago recombinante como um agente indicador da viabilidade bacilar para testar a atividade dos fármacos anti-tuberculose conclui-se que a expressão da proteína verde fluorescente foi inespecífica e não reprodutiva, não justificando o seu uso para determinar a CIM para os principais fármacos administrados no tratamento da tuberculose. / The objective of this work was to construct the recombinant phage D29::gfp and to use this phage as an indicator agent of cell viability in a minimal inhibitory concentration (MIC) assay for the mains drugs used for tuberculosis treatment. The recombinant phage contains the mycobacteria-specific hsp70 promoter controlling the green fluorescent protein gene (gfp) and was constructed by Spe I restriction in the intergenic region next to the right cohesive termini of the D29 phage genome. An hsp 70 promoter and gfp previously cloned in p YL GFP was amplified by PCR using primers with Spe I sites. The Spe I-restricted D29 phage DNA was ligated with the hsp 70-gfp fragment using T4 DNA ligase and ligated product was transformed using the packing protocol. Infection of M.smegmatis with this recombinant phage indicated the expression of green f1uorescent protein (GFP). To use the recombinant phage for assaying the activity of anti-TB drugs, 100 clinical isolates was tested for susceptibility to isoniazid (H), rifampicin (R), streptomycin (S), and ethambutol (E) using both the proportion method on Lowenstein-Jensen (L-J) medium, resazurin microtiter assay plate (REMA), as well as a microplate assay using D29::gfp. The REMA plate method showed that 30 clinical isolates were susceptible to H and 58 (66%) clinical isolates were resistant, where the MICs were 1 µg/mL or higher for 41 (71%). The R MICs for 49 (56%) resistant clinical isolates were 0,5 µg/mL for 17 (35%). The S MICs for 33 (37%) resistant clinical isolates were 2 µg/mL for 13 (40%) and E MICs for 34 (39%) resistant clinical isolates were 16 µg/mL or higher for 19 (56%). Molecular characterization by PCR IS6110 showed that 88 clinical isolates were M.tuberculosis and by PRA hsp65 were seven clinical isolates were M.kansasii and four was M.abscessus, and one M.zulgai. After using the recombinant phage as an indicator agent of cell viability for assaying the activitity of anti-TB drugs we can conclude that the expression of green fluorescent protein was non-specific and not reproducible, rendering it not useful for the determination of the MIC of the principal drugs used for the treatment of tb.