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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Este trabalho teve com objetivo o desenvolvimento e a validação/aplicação de um
sistema integrado de genotipagem de protozoários, utilizando uma abordagem
multidisciplinar envolvendo, PCR multiplex e análise bioinformática envolvendo
evolução e filogenia molecular. Para isso, trinta e seis genes ortólogos universal
(UOG) foram identificados e usados como marcadores para genotipagem de
protozoários parasitas, a nível inter-específico. Temos extraído os dados genéticos
de genes ortólogos universal selecionado. Para isso, estamos utilizando sequências
de grupos ortólogos (COG e KOG). O COG é composto de genes ortólogos
individuais ou grupos de ortólogos de parálogos de 3 ou mais linhagens
filogenéticas. Os COG de interesse selecionados estão envolvidos processo de
tradução protéica, categoria J do COG, e estes genes foram selecionados porque
eles estão presentes em todos os organismos estudados até agora, o que facilita a
montagem de um sistema integrado de protozoários patogênicos. As sequências
desses genes foram obtidos a partir do banco de dados GenBank. Seqüências de
espécies de Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum,
Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum e P. vivax foram
obtidas e armazenadas localmente. Estas sequências nucleotídicas foram traduzidas
em proteínas, e então validadas usando a ferramenta COGnitor/KOGnitor, que
mostra a sequência selecionada pertence ao respectivo COG de interesse. Após
essa validação, as sequências foram utilizadas nos alinhamentos e construção de
iniciadores que foram usados para gerar fragmentos gênicos amplificados por PCR.
Os programas para a construção dos iniciadores foram: Mafft para a construção de
alinhamentos múltiplos de cada COG, JalView para visualizá-los e o programa
Primer3 para o desenho dos iniciadores. Todo o processo foi realizado por um
pipeline de integração destes programas escritos em linguagem de programação
Perl. Após o processo automatizado de validação, alinhamento e construção dos
iniciadores, realizamos uma análise final dos iniciadores, considerando suas
características e da região de pareamento. Quando necessário, definiu-se
manualmente a degeneração da posição dos nucleotídeos que contem a variação.
Criamos 33 pares de iniciadores, que foram utilizados para a amplificação destes
genes via PCR. As reações de amplificação da PCR fora bem-sucedida em 19 UOG
nas espécies Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T.
vivax e Plasmodium vivax, utilizando-se iniciadores com posições degeneradas.
Para genotipagem das seqüências geradas pela PCR, foi utilizado o programa Phred
que realizou a leitura dos cromatogramas com qualidade por base, Phred ≥ 15, e o
programa Blast foi utilizado para a caracterização das sequências geradas, estas
duas etapas foram realizadas em pipeline de anotação que está disponível através
de um website. As árvores filogenéticas foram geradas com o método de máxima
verossimilhança utilizando o pipeline ARPA, e revelou que a metodologia apresenta
potencial para ser utilizado na genotipagem destes organismos e os genes da
metionil-tRNA sintetase e Seril-tRNA sintetase mostraram boa resolução para a
genotipagem inter-específicas de tripanosomatídeos. / The aim of this work is to develop and validate an integrated genotyping system for
protozoan parasites, using a multidisciplinary approach involving, multiplex PCR, and
bioinformatics analysis involving molecular evolution and phylogeny. For this, thirty
three universal orthologous genes (UOG) has been identified [1] and used as
markers for genotyping parasitic protozoan at the intraspecific level. We have mined
genomic data of universal orthologous genes selected. For this, we are using
sequences of orthologous groups (COGs and KOGs). The COG's consists of
individual orthologous genes or orthologous groups of paralogous of 3 or more
phylogenetic lineages. The selected COGs of interest are involved protein translation
process, category J of the COG and these genes are selected because they are
present in all organisms studied so far, facilitating the assembly of an integrated
system for the pathogenic protozoa. Note that all these genes are part of the process
of protein translation. The sequences of these genes were obtained from GenBank
database. Sequences of species, Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis,
L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum and P.
vivax were obtained and locally stored. Nucleotide sequences were translated into
proteins. So, they are validated using the Blast similarity tool and the database as the
COG itself, which shows the sequence selected belongs to the respective COG. After
this validation, the sequences were used in alignments and construction of primers
that are used to generate amplicons by PCR. The programs for the primer
construction were: Mafft for construction of multiple alignments of each COG, JalView
to view them and the program Primer3Plus [6] for the design of primers. The whole
process was performed by a pipeline integrating these programs written in Perl [7]
programming language. After the automated process of validation, alignment and
construction of the primers, we perform a final analysis of the primers manually,
which gives its characteristics and the annealing region. When necessary, we
manually define the degeneration of nucleotide position containing variations. We
have designed 33 primer pairs, and these primers were designed and used for PCR
amplification. The reactions of PCR amplification was successful for 19 UOG in
species: Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax
and Plasmodium vivax, using primers with degenerate positions. For genotyping the
sequences generates by PCR amplification was used the program Phred for reading
chromatograms file with quality ≥ 15, and Blast to the characterization of sequences
generated, this two steps was make with a pipeline and is available through a
website. The phylogenetic trees was generated with methods of maximum likelihood
using the pipeline ARPA, and revealed that the methodology has potential to be used
in genotyping of these organisms, and genes of methionyl-tRNA synthetase, seryl-
tRNA synthetase showed good resolution for the inter-specific genotyping of
trypanosomatids.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/4065 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Tschoeke, Diogo Antônio |
| Contributors | Cupolillo, Elisa, Campos, Maria Luiza Machado, Grisard, Edmundo Carlos, Dávila, Alberto Mártin Rivera |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Diogo Antonio Tschoeke, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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