Made available in DSpace on 2016-01-07T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bianca_vitorio_ioc_mest_2014.pdf: 8997482 bytes, checksum: 58bdb04feb407967d076809db7227935 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As diversas espécies de Leishmania são parasitas de considerável importância médica e econômica. As drogas atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose apresentam efeitos adversos, alta toxicidade, elevado custo e surgimento de cepas resistentes. Nesse contexto, inibidores proteolíticos é uma alternativa para o tratamento desta doença. Este estudo está focado nas calpaínas, que compreendem uma família de cisteína peptidases neutras dependentes de cálcio, envolvidas numa ampla variedade de funções fisiológicas. As calpaínas estão envolvidas em importantes doenças humanas, portanto inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos e testados para o tratamento dessas doenças, alguns encontra-se em estágios avançados de triagem clínica. Dessa forma, o presente trabalho avalia a expressão e identificação de homólogos das calpaínas em Leishmania braziliensis e o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 em ensaios in vitro. Através da busca por sequências no GenBank, alinhamentos múltiplos, filogenia e análise de domínios conservados nas sequências obtidas, selecionamos como alvo inicial sequências de calpaínas que possuíam o maior número de domínios conservados. A análise da expressão gênica relativa indica que 13 das 20 calpaínas estudadas apresentam níveis constitutivos de mRNA nas formas procíclica e metacíclica de L. braziliensis. A expressão de cinco alvos é maior na forma procíclica, e a de um alvo é maior na forma metacíclica e há expressão estágio específica de apenas um alvo na forma procíclica. A partir de análises in silico, das sequências proteicas dessas calpaínas, selecionamos uma região consenso e um peptídeo correspondente a essa região foi sintetizado e empregado na imunização de coelhos A reatividade do anticorpo gerado (Anti-TryTrip CALPAIN) foi avaliada por Western blotting, citometria de fluxo e imunocitoquímica. Em ensaios de Western blotting,verificamos que o anticorpo foi capaz de reagir contra uma proteína de 50 kDa. Já na imunolocalização foi possível observar calpaínas dispersas no citoplasma, membrana e núcleo. Além disso, através de citometria de fluxo, as moléculas homólogas às calpaínas foram identificadas em maior abundância no interior das células. Nos ensaios de inibição com o MDL28170, inibidor de calpaínas, foi possível observar a redução da proliferação nas formas promastigotas recém isoladas e múltiplas passagens de forma dose-dependente nas diferentes concentrações do inibidor ao longo de quatro dias. O efeito reversíveldo inibidor também foi avaliado nas formas promastigotas, com taxas menores comparado com o controle. O efeito do inibidor, também foi capaz de diminuir de maneira dose-dependente o índice de associação e aumentou o percentual de células com parasitos aderidos durante o processo de interação com macrófagos peritoneais. O parasito aumentou a expressão de uma peptidse clássica (gp63) quando tratado com o MDL28170, já a expressão de calpaínas e cpb não foi alterada pelo estresse induzido pelo composto. Estes dados sugerem mais estudos para melhor caracterizar as calpaínas em L. braziliensis e sugerem uma maior avaliação para uma possível associação de moléculas similares as calpaínas com a virulência ou não do parasito. Assim este trabalho acrescenta novas possibilidades para a utilização de inibidores de calpaínas como um potencial alvo de desenvolvimento para o tratamento da leishmaniose / The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis. / The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-14T13:46:13Z No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T13:46:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Este trabalho teve com objetivo o desenvolvimento e a validação/aplicação de um sistema integrado de genotipagem de protozoários, utilizando uma abordagem multidisciplinar envolvendo, PCR multiplex e análise bioinformática envolvendo evolução e filogenia molecular. Para isso, trinta e seis genes ortólogos universal (UOG) foram identificados e usados como marcadores para genotipagem de protozoários parasitas, a nível inter-específico. Temos extraído os dados genéticos de genes ortólogos universal selecionado. Para isso, estamos utilizando sequências de grupos ortólogos (COG e KOG). O COG é composto de genes ortólogos individuais ou grupos de ortólogos de parálogos de 3 ou mais linhagens filogenéticas. Os COG de interesse selecionados estão envolvidos processo de tradução protéica, categoria J do COG, e estes genes foram selecionados porque eles estão presentes em todos os organismos estudados até agora, o que facilita a montagem de um sistema integrado de protozoários patogênicos. As sequências desses genes foram obtidos a partir do banco de dados GenBank. Seqüências de espécies de Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum e P. vivax foram obtidas e armazenadas localmente. Estas sequências nucleotídicas foram traduzidas em proteínas, e então validadas usando a ferramenta COGnitor/KOGnitor, que mostra a sequência selecionada pertence ao respectivo COG de interesse. Após essa validação, as sequências foram utilizadas nos alinhamentos e construção de iniciadores que foram usados para gerar fragmentos gênicos amplificados por PCR. Os programas para a construção dos iniciadores foram: Mafft para a construção de alinhamentos múltiplos de cada COG, JalView para visualizá-los e o programa Primer3 para o desenho dos iniciadores. Todo o processo foi realizado por um pipeline de integração destes programas escritos em linguagem de programação Perl. Após o processo automatizado de validação, alinhamento e construção dos iniciadores, realizamos uma análise final dos iniciadores, considerando suas características e da região de pareamento. Quando necessário, definiu-se manualmente a degeneração da posição dos nucleotídeos que contem a variação. Criamos 33 pares de iniciadores, que foram utilizados para a amplificação destes genes via PCR. As reações de amplificação da PCR fora bem-sucedida em 19 UOG nas espécies Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax e Plasmodium vivax, utilizando-se iniciadores com posições degeneradas. Para genotipagem das seqüências geradas pela PCR, foi utilizado o programa Phred que realizou a leitura dos cromatogramas com qualidade por base, Phred ≥ 15, e o programa Blast foi utilizado para a caracterização das sequências geradas, estas duas etapas foram realizadas em pipeline de anotação que está disponível através de um website. As árvores filogenéticas foram geradas com o método de máxima verossimilhança utilizando o pipeline ARPA, e revelou que a metodologia apresenta potencial para ser utilizado na genotipagem destes organismos e os genes da metionil-tRNA sintetase e Seril-tRNA sintetase mostraram boa resolução para a genotipagem inter-específicas de tripanosomatídeos. / The aim of this work is to develop and validate an integrated genotyping system for protozoan parasites, using a multidisciplinary approach involving, multiplex PCR, and bioinformatics analysis involving molecular evolution and phylogeny. For this, thirty three universal orthologous genes (UOG) has been identified [1] and used as markers for genotyping parasitic protozoan at the intraspecific level. We have mined genomic data of universal orthologous genes selected. For this, we are using sequences of orthologous groups (COGs and KOGs). The COG's consists of individual orthologous genes or orthologous groups of paralogous of 3 or more phylogenetic lineages. The selected COGs of interest are involved protein translation process, category J of the COG and these genes are selected because they are present in all organisms studied so far, facilitating the assembly of an integrated system for the pathogenic protozoa. Note that all these genes are part of the process of protein translation. The sequences of these genes were obtained from GenBank database. Sequences of species, Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum and P. vivax were obtained and locally stored. Nucleotide sequences were translated into proteins. So, they are validated using the Blast similarity tool and the database as the COG itself, which shows the sequence selected belongs to the respective COG. After this validation, the sequences were used in alignments and construction of primers that are used to generate amplicons by PCR. The programs for the primer construction were: Mafft for construction of multiple alignments of each COG, JalView to view them and the program Primer3Plus [6] for the design of primers. The whole process was performed by a pipeline integrating these programs written in Perl [7] programming language. After the automated process of validation, alignment and construction of the primers, we perform a final analysis of the primers manually, which gives its characteristics and the annealing region. When necessary, we manually define the degeneration of nucleotide position containing variations. We have designed 33 primer pairs, and these primers were designed and used for PCR amplification. The reactions of PCR amplification was successful for 19 UOG in species: Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax and Plasmodium vivax, using primers with degenerate positions. For genotyping the sequences generates by PCR amplification was used the program Phred for reading chromatograms file with quality ≥ 15, and Blast to the characterization of sequences generated, this two steps was make with a pipeline and is available through a website. The phylogenetic trees was generated with methods of maximum likelihood using the pipeline ARPA, and revealed that the methodology has potential to be used in genotyping of these organisms, and genes of methionyl-tRNA synthetase, seryl- tRNA synthetase showed good resolution for the inter-specific genotyping of trypanosomatids.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:15:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_bezerra_ioc_dout_2012.pdf: 3641805 bytes, checksum: 551d726828aba255caeef4c323eae9ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Esta tese descreve o projeto conceitual do sistema de banco de dados ProteinWorldDB (PWDB). Um ponto importante da proposta do PWDB é permitir a construção de consultas e procedimentos no domínio da genômica comparativa sem a necessidade de comparação de sequências. Além disso, o PCG comparou milhões de sequências de proteína, incluindo o conjunto proteico total de centenas de genomas completos, utilizando programação dinâmica, e não um método heurístico, para os cálculos de similaridade. A estratégia do PCG, assim como a genômica, está fundamentada no conhecimento de que sequências biológicas por si só são pouco informativas; elas precisam ser analisadas a partir de um enfoque comparativo para a inferência de homologia. A comparação de sequências de diferentes organismos introduz uma perspectiva evolutiva ao processo, e o estudo comparativo de genomas completos pode ampliar a escala do conhecimento de um único processo biológico para o de sistemas biológicos complexos em células e organismos. Para responder eficientemente questões dessa natureza, o esquema conceitual apresentado associa bases de dados biológicos de referência aos índices de similaridade já pré-calculados e armazenados pelo PCG Utilizando um formato gráfico de fácil compreensão para representar conceitos e relacionamentos (diagrama ER), o esquema foi proposto para facilitar o planejamento de consultas e procedimentos por pesquisadores da área de genômica (sem conhecimento de linguagens de bancos de dados), assim como guiar o desenvolvimento e a implementação física do PWDB por profissionais da área de computação. Alguns exemplos são apresentados com o objetivo de demonstrar a utilização do esquema conceitual para a especificação de consultas e procedimentos, mesmo antes da existência de um esquema lógico. O esquema pode ser facilmente estendido. Módulos anexos podem ser inseridos/removidos para incluir outros projetos, baseados em comparação de sequências de proteína, que se beneficiem das informações fornecidas pelo módulo central do esquema e novas bases de dados, específicas de diferentes áreas (-ômicas, por exemplo), podem ser integradas ao esquema / This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema / This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-20T17:10:28Z No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-20T17:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) Previous issue date: 2006 / Cnpq / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O estudo de tripanosomatídeos de plantas teve início em 1909, quando foram encontradas formas flageladas em látex, sendo depois encontradas em floema, frutas e flores. Desde a refutada tentativa de Donovan de criar o gênero Phytomonas, temos atualmente, várias espécies classificadas dentro do gênero Phytomonas, incluíndo Phytomonas serpens, organismo alvo de nosso estudo. O ciclo de vida de P. serpens compreende planta e inseto. A transmissão é feita do tomate para inseto, do inseto para tomate. O vetor natural é o hemíptero Phthia picta (Hemiptera: Coriidae) que quando se alimenta de tomates infectados, se torna infectado após 10 a 15 dias, apresentando parasitos nas fezes, urina, tubo digestivo e glândulas salivares. Pouco se sabe sobre P. serpens e o conhecimento é ainda mais escasso se levarmos em conta todos os organismos dentro do gênero Phytomonas. O objetivo deste projeto é explorar o genoma de P. serpens gerando e analisando seqüências de seu genoma, aumentando o conhecimento deste organismo e comparando seu genoma com outros organismos. A cepa 9T de P. serpens (CT–IOC-174) foi cultivada a 27oC em meio Schneiders ́insect medium suplementado com 10% de soro fetal bovino. O DNA genômico foi extraído por lise alcalina para a construção da biblioteca genômica. O DNA foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A. Os fragmentos de DNA com tamanhos entre 1-3 kb foram recuperados do gel de agarose e purificados. Os fragmentos de DNA foram clonados no sítio BamHI do vetor de clonagem pUC18. A reação de sequenciamento foi realizada na plataforma de sequenciamento ABI3730 – 48 capilar PDTIS/FIOCRUZ e na plataforma MegaBase na UERJ. Todas as seqüências foram armazenadas em banco de dados “open source” nos servidores Linux no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos (DBBM/IOC/FIOCRUZ). Foram seqüenciados 829 clones da biblioteca de DNA genômico obtendo-se um total de 379 seqüências GSS (Genomic Sequence Survey) de alta qualidade. Foram utilizadas para a complementação deste estudo, as seqüências do projeto EST de P. serpens que estavam disponíveis no GenBank. Os 221 clusters GSS e os 697 clusters de EST (Expressed Sequence Tag) foram comparados com o programa de busca de similaridade Blast a diferentes bancos de dados, utilizando como parâmetro evalue 10 -5, gerando 599 clusters com entradas positivas (Hits) e 303 clusters com nenhum hit, representando possíveis genes espécie específicos. Os clusters foram anotados de acordo com sua função quando comparados ao banco de dados Gene Ontology (GO) representando uma análise inédita no genoma de P.serpens. Inferências filogenéticas e de similaridade com o banco “Taxonomy” do NCBI foram realizados, usando inclusive seqüências do genoma ambiental, para verificar se as mesmas pertencem a Kinetoplastida, o que não se comprovou. As inferências filogenéticas realizadas com genes concatenados mostraram que P. serpens é mais próximo de T. cruzi, enquanto que inferências com genes individuais apontaram para L. major. Com base na literatura, inferimos que a análise da árvore de genes concatenados é correta. Foram encontradas com o GLIMMER 20 genes hipotéticos nas seqüências de GSS. Encontramos 22 cluters em GSS que não foram encontrados anteriormente em EST, como por exemplo, Piroglutamil-peptidase I, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Peptidase_M8. / The study of trypanosomatids of plants began in 1909, when flagellate forms were found in latex from Euphorbiaceae, being later found in phloem, fruits/seeds and flowers in a wide variety of plants species. Since the refuted attempt of Donovan to create the genus Phytomonas, a great number of species were classified in the genus Phytomonas, including Phytomonas serpens, the major organism of our study. The described life cycle of P. serpens involves plant (tomato) and insect. The natural vector is the Coreid bug, Phthia picta (Hemiptera: Coriidae), that becomes infected 10 a 15 days after feeding on infected tomatoes, presenting the parasite in excrements, urine, digestive tube and salivary glands. Very little is known about these organisms and even less is known about the genus Phytomonas. The goal of this project is to explore the P. serpens genome by generating and analyzing sequences of its genome aiming to increase the knowledge of this organism and to analyze comparatively with genomes of other organisms. P. serpens infects tomatoes but we still have doubts about its pathogenicity. A strain of P. serpens 9T (CT-IOC-174) was cultured at 27oC in Schneiders ́insect medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum. The DNA was extracted by alkaline lyses for the construction of a genomic library. Genomic DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3A. DNA fragments with an average size of 1.0-3.0 kb were recovered and purified from agarose gel. DNA inserts were cloned into the BamHI restriction site of pUC18 cloning vector. The sequencing reaction was made at the Sequencing Platform ABI3730 - PDTIS/FIOCRUZ and MegaBase platform at UERJ. All the sequences were stored in an open source database in the Linux server in the Laboratory of Molecular Biology of Trypanosomatids and Phlebotomines (DBBM/IOC/FIOCRUZ). 829 clones of the P. serpens genomic DNA library were sequenced obtaining a total of 379 high quality sequences GSS (Genome Sequence Survey). Sequences from the EST (Expressed Sequence Tag) project of P. serpens available at GenBank were used for the complementation of this study. 221 GSS clusters and 697 EST clusters were compared with different databases with the similarity search program Blast, using evalue 10 -5 as default, obtaining 599 clusters with positive hits and 303 clusters without hit, indicating possible species-specific genes. 357 clusters that were identified when compared with Gene Ontology (GO) had their function classified, representing the first analysis of P. serpens genome using GO. Phylogenetics and similarity studies with Taxonomy database from NCBI were carried out confirming the position of P. serpens in relations to the others trypanosomatids and disclosing similarity with T. cruzi genome. The phylogenetic study included sequences of the enviromental genome, in order to verify if these sequences belong to the Kinetoplastid, what was not proven to be true. Phylogenetic studies using concatenated genes showed that P. serpens is phylogenetically closer to T. cruzi, but studies with individuals genes pointed to L. major. Based on literature, we infer that the analysis of the tree of concatenated genes is correct. 20 hypothetical genes in the GSS sequences were found with the GLIMMER. We found 22 clusters in GSS sequences that were not found in EST before, among others, Pyroglutamil-peptidase I, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Peptidase_M8.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-09-19T13:39:08Z No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-19T13:39:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 renato_s_junior_ioc_bp_0048_2011.pdf: 2131023 bytes, checksum: c67826382b4b8b6c00b329a3f8c712d2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Universidade Federal Fluminense. Centro de Estudos Gerais. Instituto de Biologia. Niteroi, RJ, Brasil / A família Trypanosomatidae inclui parasitas de uma grande variedade de vertebrados, invertebrados (principalmente insetos), plantas e algumas espécies de protozoários, sendo, depois do nematóides, os de maior distribuição de hospedeiros na natureza. No presente trabalho, um novo isolado foi obtido por coprocultivo de trato intestinal de Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae), capturado no município de Itaguaí/RJ. O isolado original e três clones (obtidos por citometria de fluxo) foram depositados na "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmanioses." Um clone foi caracterizado por diversas abordagens em comparação com espécies de referência de diferentes gêneros. Foi analisado o crescimento em meio de cultivo em intervalos de 24 h, entre 48-144 h, a diferenciação celular e a morfometria dos principais estágios evolutivos encontrados. A análise de isoenzimas foi realizada utilizando-se os seguintes sistemas: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH e ACON. RAPD-PCR foi realizado utilizando-se 6 iniciadores, conjuntamente com outros tripanosomatídeos. Os dados destas análises foram processados numericamente e submetidos à análise computacional utilizando-se o coeficiente de associação Jaccard e o algoritmo de agrupamento UPGMA. Realizou-se seqüenciamento do amplicon do gene de SSU rRNA e o fragmento analisado foi alinhado com vinte e uma seqüencias depositadas no GenBank, gerando uma árvore filogenética resultante do pareamento. O conjunto de resultados deste trabalho sugere que a amostra obtida constitui nova espécie, pertencendo a um novo gênero, nomeada Vickermania itaguaiensis. / The Trypanosomatidae family includes parasites of a wide variety of vertebrates, invertebrates (mainly insects), plants and some species of protozoa, and after the nematodes, the highest distribution of hosts in nature. In this study, an isolate was obtained by coproculture from Leptoglossus stigma Herb, 1784 (Hemiptera, Coreidae) intestinal tract, captured in the city of Itaguaí/RJ. The original isolate and clones (obtained by flow cytometry) were deposited in the "Coleção de Flagelados do Laboratório de Transmissores de Leishmaniose". One clone was characterized by several approaches in comparison with the reference species of different genus. Growth was analyzed in culture medium at 24 h intervals between 48-144 h, cell differentiation and morphometric parameters of the main evolutionary stages matches. The isoenzyme analysis was performed using the following systems: GPI, PGM, 6PGDH, HK, ACON, MPI, FUM, IDH, MDH and ACON. RAPD-PCR was performed using 6 primers, together with other trypanosomatids. The analysis of these data were numerically processed and submitted to computer analysis using the Jaccard association coefficient and UPGMA clustering algorithm. We carried out sequencing of the amplicon from SSU rRNA gene and the fragment analyzed was aligned with twenty-one sequences deposited in GenBank, generating a phylogenetic tree resulting from the pairing. The result set of this work suggests that the sample obtained represents a new species belonging to a new genus, named Vickermania itaguaiensis.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T15:22:16Z No. of bitstreams: 1 Tese Monica Lemos Ammon Fernandez.pdf: 8355019 bytes, checksum: dfee6b67fb0314370a761d01a0ee90d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T15:22:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Monica Lemos Ammon Fernandez.pdf: 8355019 bytes, checksum: dfee6b67fb0314370a761d01a0ee90d4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Febre Q é uma zoonose cosmopolita causada por Coxiella burnetii, pequena bactéria intracelular obrigatória gram-negativa e pleomórfica da ordem Legionellales. A doença, que ocorre como pequenos surtos ou como casos isolados, tem amplo espectro de manifestações clínicas, desde uma doença febril limitada, pneumonia, hepatite a endocardite e meningoencefalite. Carrapatos, animais de fazenda, domésticos e selvagens são reservatórios da infecção. A transmissão para o homem ocorre por inalação de aerossóis provenientes de urina, fezes, leite e produtos de abortamento ou menos comumente pela ingestão de leite cru de animais infectados. No Brasil, desde a primeira descrição de febre Q em 1953, em São Paulo, todos os casos têm sido identificados com base em teste sorológico e os poucos estudos soroepidemiológicos em população de risco apontam para a circulação de C. burnetii. Em 2008 foi possível confirmar um caso de febre Q em um paciente, a partir de análise sorológica e molecular. Com o objetivo de rastrear um foco de infecção por C. burnetii, um estudo epidemiológico descritivo foi desenvolvido na área de ocorrência do primeiro caso no Brasil de febre Q confirmado, em 2008, por análise molecular, no Município de Itaboraí, Rio de Janeiro. Análises sorológicas e moleculares foram realizadas em amostras biológicas de familiares e de cães, gatos, cabras e equinos existentes na área estudada, em 2009. Amostras de soro foram submetidas ao teste comercial de imunofluorescência indireta (PANBIOTM), título de corte de 64, para a pesquisa de anticorpo anti-C. burnetii, fases I e II. Amostras de sangue dos familiares e dos animais, assim como de leite, fezes e de secreção nasal, vaginal, além dos artrópodes, coletados nos animais, foram submetidas à PCR (reação em cadeia da polimerase) para a presença da bactéria, utilizando oligonucleotídeos para o gene alvo htpAB. Reatividade foi identificada em amostras de soro da esposa, de 2 dos 13 caninos, 05 de 10 caprinos e 02 das 03 ovinos. O genoma foi recuperado em amostra de sangue e/ou leite ou swab anal de 02 cães e 06 cabras. O sequenciamento dos produtos de PCR amplificados, do soro dos cães e do leite das cabras, mostraram identidade de 99% para as sequências depositadas no GenBank. Embora não seja uma doença de notificação, os dados obtidos confirmam a circulação deste agente zoonótico e servem de alerta para a necessidade de vigilância epidemiológica da febre Q, em especial em Itaboraí, devido, entre outros fatores, ao crescente desmatamento com ocupação de vastas áreas e da criação, informal e de caráter familiar, de cabras leiteiras por pequenos proprietários nas diversas áreas do território nacional. / Q fever is a zoonosis caused by Coxiella burnetii, a obligate intracellular and pleomorphic, small gram-negative bacterium of Legionellales order. The disease, which can occur as small outbreaks or isolated cases, has a broad spectrum of clinical manifestations, from a limited febrile illness, pneumonia, hepatitis, endocarditis, and meningoencephalitis. Ticks, farm animals, domestic and wild are reservoirs of infection. Transmission to humans occurs through inhalation of aerosols from urine, feces, milk and products of abortion or less commonly by ingestion of raw milk from infected animals. In Brazil, since the first description of Q fever in 1953, in Sao Paulo, cases have been identified by serological tests and very few seroepidemiological studies in the population at risk have been performed showing the circulation of C. burnetii. In 2008 it was possible to confirm a case of Q fever in a patient, from molecular and serological analysis. Aiming to track the source of infection for C. burnetii, a descriptive epidemiologic study was developed in the area of occurrence of the first case of Q fever in Brazil in 2008, confirmed by molecular analysis in Itaboraí, Rio de Janeiro. Serological and molecular analysis was performed on biological samples from family and dogs, cats, goats and horses in the area of studied in 2009. Serum samples were tested with commercial indirect immunofluorescence (PANBIOTM), a cutoff of 64, for the detection of anti-C. burnetii, phases I and II. Blood samples from family members and animals, like milk, feces and nasal discharge, vaginal, and arthropods collected in animals were subjected to PCR (polymerase chain reaction) for the presence of bacteria, using primers for htpAB the target gene. Reactivity was detected in serum samples from his wife, two of the 13 dogs, 05 of 10 goats and 02 of 03 sheeps. The genome was recovered in a sample of blood and / or milk or anal swabs from 02 dogs and 06 goats. The sequencing of the PCR products amplified from the serum of dogs and goats' milk, showed 99% identity to the sequences deposited in GenBank Although not a notifiable disease, our data confirm the circulation of this zoonotic agent and serve as a reminder of the need for surveillance of Q fever, especially in Itaboraí due, among other factors, the increasing deforestation and occupation of vast areas and the creation of informal and familiar character in dairy goats by smallholders in various areas of the country.