Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_D.pdf: 7821596 bytes, checksum: b0f165c3b35ff62438f4e8f59035eb82 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O processo de biodegradação do petróleo em reservatórios pode resultar em mudanças na composição e propriedades físico-químicas de óleos brutos e gases naturais, as quais levam à diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados, produzindo óleos mais pesados e com baixo valor econômico. O uso combinado de técnicas dependentes e independentes de cultivo pode nos permitir um melhor entendimento acerca da comunidade de micro-organismos que habita os reservatórios de petróleo, incluindo aqueles responsáveis por esta biodegradação. O conhecimento sobre a composição microbiana, suas funções e interações com outros micro-organismos e com o ambiente pode levar à definição de estratégias de monitoramento e/ou controle da biodegradação em reservatórios. Este estudo teve como finalidade avaliar a diversidade de micro-organismos e genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos presentes em amostras de petróleo provenientes de dois poços terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado), através da construção de bibliotecas de genes catabólicos (alcano monooxigenases - alk, dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos ¿ ARHDs e 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hidroxilase - bamA) e sequenciamento em larga escala de metagenoma e metatranscriptoma de enriquecimentos microbianos aeróbios. Os resultados obervados mostraram uma distribuição diferencial dos genes catabólicos entre os reservatórios, sendo o óleo biodegradado mais diverso para os genes alk e bamA. As sequências foram semelhantes aos genes alkB dos gêneros Geobacillus, Acinetobacter e Streptomyces, aos genes ARHD dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia, e aos genes bamA do gênero Syntrophus. A análise quantitativa dos genes catabólicos de degradação de hidrocarbonetos presentes e expressos nos enriquecimentos microbianos em diferentes etapas da biodegradação do óleo, através de PCR Tempo Real, demonstrou maior atividade do gene que codifica a enzima dioxigenase nas comunidades microbianas enriquecidas, e os resultados obtidos pela técnica de microarray sugeriram a existência de novas sequências dos genes alk e ARHD provindas do reservatório de petróleo. As análises das sequências obtidas a partir do metagenoma e metatranscriptoma mostraram que a comunidade bacteriana recuperada no enriquecimento aeróbio é bastante diversa, com predominância do Filo Actinobacteria, seguido de Proteobacteria. As sequências com maior abundância e níveis de expressão foram relacionadas aos genes que codificam as proteínas ligase CoA de ácido graxo de cadeia longa, envolvida na degradação de compostos aromáticos; descarboxilase, envolvida com o ciclo do glioxilato, e o fator sigma da RNA polimerase, envolvida com a regulação da resposta ao estresse oxidativo, sugerindo uma adaptação da comunidade microbiana às condições do enriquecimento e um processo inicial de biodegradação dos hidrocarbonetos. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados inéditos sobre a diversidade de genes catabólicos e de membros da comunidade microbiana potencialmente envolvidos com a degradação do óleo em reservatórios de petróleo / Abstract: The process of oil biodegradation in reservoirs may result in changes in the composition and physico-chemical properties of crude oils and natural gases, which lead to the decrease of the content of saturated hydrocarbons, producing heavy oils and with low economic value. The combined use of both dependent and independet cultivation techniques may allow us to better understand the microbial community inhabiting oil reservoirs, including those microorganisms responsible for oil degradation. The knowledge about the microorganisms, ther functions and interactions with other microorganisms and the environment may lead to the definition of monitoring and/or control strategies of biodegradation in oil reservoirs. This study aimed at evaluating the diversity of microorganisms and genes involved in the degradation of hydrocarbons present in oil samples from two onshore reservoirs at Potiguar Basin (RN), identified as GMR75 (biodegraded) and PTS1 (non- biodegraded), through the construction of catabolic gene libraries (alkane monooxygenases - alk, aromatic ring hydroxylating dioxygenases ¿ ARHD and 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hydroxylase - bamA) and highthroughput sequencing of metagenome and metatranscriptome from aerobic microbial enrichments. Results observed showed a differential distribution of catabolic genes between the reservoirs, being the biodegraded oil more diverse for the alk and bamA genes. The sequences were similar to alkB genes from Geobacillus, Acinetobacter and Streptomyces genera, to the ARHD genes from Pseudomonas and Burkholderia genera, and to the bamA genes from Syntrophus genus. Quantitative analysis of the hydrocarbon degradation genes present and expressed in the microbial enrichments during the different phases of oil biodegradation by Real-Time PCR showed that there was a higher activity of dioxygenase enzymes in the enriched microbial communities and results from microarray assays suggested the existence of new alk and ARHD gene sequences originated from the oil reservoir. Metagenomic and metatranscriptomic analyses showed a highly diverse bacterial community, dominated by the Phylum Actinobacteria, followed by Proteobacteria. The most abundant and active sequences were affiliated to the Long-chain-fatty-acid-CoA ligase protein, involved in the degradation of aromatic compounds; decarboxylase, which is involved with the glyoxylate cycle, and RNA polymerase sigma factor, which is involved in regulating the oxidative stress response, suggesting an adaptation of the microbial community to the enrichment conditions and an initial process of biodegradation of hydrocarbon compounds. The results obtained in this work bring innovative data on the diversity of catabolic genes and microbial community members potentially involved with oil degradation in petroleum reservoirs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:04:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maria_CarlaCristinaJudice_D.pdf: 2319952 bytes, checksum: e037242b656f9d55edeac4eaeb12cfb4 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: O polifenismo de castas é um fenômeno multifacetado, sendo mais evidente em diferenças na capacidade reprodutiva e na longevidade entre rainhas e operárias. No presente estudo, a abelha sem ferrão Melipona quadrifasciata anthidioides foi escolhida para a investigação de diferenças na expressão gênica entre rainhas e operárias recém nascidas. Este estudo foi focalizado em adultos recém nascidos pois esse estágio representa o ponto final do desenvolvimento embrionário e o ponto inicial para o desempenho de tarefas casta-específicas. Inicialmente, foi empregada a metodologia do ¿differential display reverse transcription (DDRT)-PCR¿ e podendo ser detectada a expressão diferenciada de 14 genes entre rainhas e operárias. As diferenças no perfil de expressão foram posteriormente analisadas através de duas bibliotecas subtrativas de cDNA: uma representando genes muito expressos ou induzidos em operárias quando em comparação com rainhas, e a outra representando genes mais expressos na casta rainha. Embora o número total de seqüências geradas não tenha permitido uma compreensão completa dos transcriptomas das castas, foi possível detectar em rainhas a predominância de genes envolvidos na regulação transcricional e no metabolismo, em relação à ampla diversidade de categorias funcionais das ESTs encontradas na casta operária. Um outro grupo representando seqüências de funções desconhecidas apresentou elevada similaridade a seqüências de Apis mellifera, podendo, portanto, conter genes candidatos para investigações em processos específicos das abelhas sociais ou do desenvolvimento de castas de maneira geral. Além disso, este estudo questionou se rainhas induzidas pelo tratamento com hormônio juvenil (HJ) durante a fase larval poderiam apresentar níveis de expressão gênica similares aos de uma rainha produzida de modo natural. Curiosamente, os dados preliminares sugerem que a rainha artificial não apresenta o mesmo transcriptoma de uma rainha natural, indicando que o HJ pode induzir a diferenciação, mas não em todos os aspectos / Abstract: Caste polyphenism is a multifaceted phenomenon, most evident in the marked differences in reproductive capacity and longevity between queens and workers. In the present study, the stingless bee Melipona quadrifasciata anthidioides was chosen to investigate differences in gene expression between newly emerged adult queens and workers. This study has focused on newly emerged adults since this stage represents the endpoint of post-embryonic development and the starting point for caste-specific task performance.Initially, the methodology of differential display reverse transcription (DDRT)-PCR was employed and the differential expression for 14 M. quadrifasciata genes could be detected between queens and workers. The differences in the expression profile of the castes were further analysed through two subtractive cDNA libraries: one representing the genes that are overexpressed in workers, when compared with queens and the other representing genes which are overexpressed in queens.Although the total number of sequence does not allow a comprehensive picture of the caste transcriptomes, there seems to exist a predominance of genes involved in transcriptional regulation and metabolism in the queen ESTs, versus a much broader spectrum of categories in the worker ESTs. Another group representing sequences with unknown function displayed significant matches only with the Apis database and, therefore, may contain candidates for further investigations on processes specific to social bees or caste development in general.In addition, this study addressed the question of whether queens induced by treatment with juvenile hormone (JH) during the larval phase display genes with similar expression levels as naturally produced queens. Remarkably, our preliminary data suggest that the artificial queen does not present the same transcriptome of a natural queen, indicating that JH may not induce all aspects of the differentiation process / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

Orientador: Valéria Maia Merzel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-28T00:18:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Belgini_DaianeRodriguesBarbosa_M.pdf: 4350336 bytes, checksum: 998807ac1631e5c151a33202b7d5f9a0 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Com o intuito de otimizar o consumo de água do meio ambiente, o reuso de efluentes têm sido cada vez mais empregado. Dentre as diferentes tecnologias utilizadas no tratamento de efluentes para reuso, os sistemas de osmose inversa se destacam por oferecer vantagens como: economia, alta produtividade e alta eficiência na remoção de sais. Entretanto, estes sistemas estão constantemente sujeitos à contaminação por micro-organismos, o que leva à perda da eficiência e aumento nos custos operacionais e de manutenção. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo a caracterização da diversidade bacteriana de um sistema de membranas de osmose inversa que trata efluente de uma refinaria de petróleo, a fim de determinar quais são os micro-organismos relacionados com a formação de biofilme. A diversidade planctônica do sistema, i.e., água de alimentação, foi analisada através de plaqueamento e cultivo e de bibliotecas de genes RNA ribossomal 16S. A diversidade bacteriana associada às membranas foi analisada através de fingerprinting genético (DGGE ¿ Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) e construção de bibliotecas de genes ribossomais 16S. A partir das amostras de água de alimentação, foram obtidos 37 isolados bacterianos e 211 clones. A análise das membranas foi realizada através do sequenciamento e identificação de 13 bandas excisadas a partir do fingerprinting genético, assim como pela construção de duas bibliotecas gênicas, com 73 e 57 clones cada uma. Dentre os gêneros encontrados nas diferentes amostras, os mais representativos e com potencial para formação inicial de biofilmes foram: Acidovorax, Bosea, Methylibium, Novosphingobium, Rhizobium, Shinella, Sphingomonas, Sphingobium, Devosia, Microbacterium e Sphingopyxis. De acordo com a literatura, alguns destes gêneros são constantemente encontrados em sistemas aquáticos e são importantes na formação inicial de biofilmes em sistemas de osmose inversa. O conhecimento da diversidade de micro-organismos presentes nestes sistemas fornece subsídios para entender a dinâmica e os mecanismos de formação de biofilmes na superfície de membranas, permitindo o o desenvolvimento de estratégias de controle e remoção mais específicas / Abstract: In order to reduce the environmental water consumption, reuse of wastewater has been increasingly employed. Among the different technologies used in the treatment of wastewater for reuse, reverse osmosis system stands out because of its advantages such as economy, high productivity and high efficiency in the removal of salts. However, these systems are constantly subjected to contamination by microorganisms, which causes loss of efficiency and increase in operating and maintenance costs. In this context, this study aims to characterize the bacterial diversity of a reverse osmosis membrane system treating effluent of an oil refinery in order to determine which are the microorganisms related to biofilm formation. The planktonic diversity of the system, i.e. feed water, was analyzed by cultivation techniques and 16S ribosomal gene clone libraries. Bacterial diversity associated with membranes was analyzed through genetic fingerprinting (DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) and the construction of 16S ribosomal gene libraries. Approximately 37 isolates and 211 clones were obtained from the feed water samples. Analysis of the membranes was performed by sequencing and identification of 13 excised bands from DGGE gel, as well as the construction of two 16S rRNA gene libraries. Among the genera found in the samples, the most representative and with potential to initial biofilm formation were Acidovorax, Bosea, Methylibium, Novosphingobium, Rhizobium, Shinella, Sphingomonas, Sphingobium, Devosia, Microbacterium and Sphingopyxis. According to the literature, some of these genera are constantly found in aquatic systems and are important in the initial formation of biofilms in reverse osmosis systems. Knowledge of the diversity of microorganisms in these systems provides subsidies to understand the dynamics and mechanisms of biofilm formation on the surface of membranes, allowing further development of control and more specific removal strategies / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-07-20T17:10:28Z No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-20T17:10:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 prisicila_mo_costa_ioc_bp_0037_2006.pdf: 2669544 bytes, checksum: 9b2e6aaf65027a066f8ad3713540db99 (MD5) Previous issue date: 2006 / Cnpq / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O estudo de tripanosomatídeos de plantas teve início em 1909, quando foram encontradas formas flageladas em látex, sendo depois encontradas em floema, frutas e flores. Desde a refutada tentativa de Donovan de criar o gênero Phytomonas, temos atualmente, várias espécies classificadas dentro do gênero Phytomonas, incluíndo Phytomonas serpens, organismo alvo de nosso estudo. O ciclo de vida de P. serpens compreende planta e inseto. A transmissão é feita do tomate para inseto, do inseto para tomate. O vetor natural é o hemíptero Phthia picta (Hemiptera: Coriidae) que quando se alimenta de tomates infectados, se torna infectado após 10 a 15 dias, apresentando parasitos nas fezes, urina, tubo digestivo e glândulas salivares. Pouco se sabe sobre P. serpens e o conhecimento é ainda mais escasso se levarmos em conta todos os organismos dentro do gênero Phytomonas. O objetivo deste projeto é explorar o genoma de P. serpens gerando e analisando seqüências de seu genoma, aumentando o conhecimento deste organismo e comparando seu genoma com outros organismos. A cepa 9T de P. serpens (CT–IOC-174) foi cultivada a 27oC em meio Schneiders ́insect medium suplementado com 10% de soro fetal bovino. O DNA genômico foi extraído por lise alcalina para a construção da biblioteca genômica. O DNA foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A. Os fragmentos de DNA com tamanhos entre 1-3 kb foram recuperados do gel de agarose e purificados. Os fragmentos de DNA foram clonados no sítio BamHI do vetor de clonagem pUC18. A reação de sequenciamento foi realizada na plataforma de sequenciamento ABI3730 – 48 capilar PDTIS/FIOCRUZ e na plataforma MegaBase na UERJ. Todas as seqüências foram armazenadas em banco de dados “open source” nos servidores Linux no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos (DBBM/IOC/FIOCRUZ). Foram seqüenciados 829 clones da biblioteca de DNA genômico obtendo-se um total de 379 seqüências GSS (Genomic Sequence Survey) de alta qualidade. Foram utilizadas para a complementação deste estudo, as seqüências do projeto EST de P. serpens que estavam disponíveis no GenBank. Os 221 clusters GSS e os 697 clusters de EST (Expressed Sequence Tag) foram comparados com o programa de busca de similaridade Blast a diferentes bancos de dados, utilizando como parâmetro evalue 10 -5, gerando 599 clusters com entradas positivas (Hits) e 303 clusters com nenhum hit, representando possíveis genes espécie específicos. Os clusters foram anotados de acordo com sua função quando comparados ao banco de dados Gene Ontology (GO) representando uma análise inédita no genoma de P.serpens. Inferências filogenéticas e de similaridade com o banco “Taxonomy” do NCBI foram realizados, usando inclusive seqüências do genoma ambiental, para verificar se as mesmas pertencem a Kinetoplastida, o que não se comprovou. As inferências filogenéticas realizadas com genes concatenados mostraram que P. serpens é mais próximo de T. cruzi, enquanto que inferências com genes individuais apontaram para L. major. Com base na literatura, inferimos que a análise da árvore de genes concatenados é correta. Foram encontradas com o GLIMMER 20 genes hipotéticos nas seqüências de GSS. Encontramos 22 cluters em GSS que não foram encontrados anteriormente em EST, como por exemplo, Piroglutamil-peptidase I, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Peptidase_M8. / The study of trypanosomatids of plants began in 1909, when flagellate forms were found in latex from Euphorbiaceae, being later found in phloem, fruits/seeds and flowers in a wide variety of plants species. Since the refuted attempt of Donovan to create the genus Phytomonas, a great number of species were classified in the genus Phytomonas, including Phytomonas serpens, the major organism of our study. The described life cycle of P. serpens involves plant (tomato) and insect. The natural vector is the Coreid bug, Phthia picta (Hemiptera: Coriidae), that becomes infected 10 a 15 days after feeding on infected tomatoes, presenting the parasite in excrements, urine, digestive tube and salivary glands. Very little is known about these organisms and even less is known about the genus Phytomonas. The goal of this project is to explore the P. serpens genome by generating and analyzing sequences of its genome aiming to increase the knowledge of this organism and to analyze comparatively with genomes of other organisms. P. serpens infects tomatoes but we still have doubts about its pathogenicity. A strain of P. serpens 9T (CT-IOC-174) was cultured at 27oC in Schneiders ́insect medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum. The DNA was extracted by alkaline lyses for the construction of a genomic library. Genomic DNA was partially digested with the restriction enzyme Sau3A. DNA fragments with an average size of 1.0-3.0 kb were recovered and purified from agarose gel. DNA inserts were cloned into the BamHI restriction site of pUC18 cloning vector. The sequencing reaction was made at the Sequencing Platform ABI3730 - PDTIS/FIOCRUZ and MegaBase platform at UERJ. All the sequences were stored in an open source database in the Linux server in the Laboratory of Molecular Biology of Trypanosomatids and Phlebotomines (DBBM/IOC/FIOCRUZ). 829 clones of the P. serpens genomic DNA library were sequenced obtaining a total of 379 high quality sequences GSS (Genome Sequence Survey). Sequences from the EST (Expressed Sequence Tag) project of P. serpens available at GenBank were used for the complementation of this study. 221 GSS clusters and 697 EST clusters were compared with different databases with the similarity search program Blast, using evalue 10 -5 as default, obtaining 599 clusters with positive hits and 303 clusters without hit, indicating possible species-specific genes. 357 clusters that were identified when compared with Gene Ontology (GO) had their function classified, representing the first analysis of P. serpens genome using GO. Phylogenetics and similarity studies with Taxonomy database from NCBI were carried out confirming the position of P. serpens in relations to the others trypanosomatids and disclosing similarity with T. cruzi genome. The phylogenetic study included sequences of the enviromental genome, in order to verify if these sequences belong to the Kinetoplastid, what was not proven to be true. Phylogenetic studies using concatenated genes showed that P. serpens is phylogenetically closer to T. cruzi, but studies with individuals genes pointed to L. major. Based on literature, we infer that the analysis of the tree of concatenated genes is correct. 20 hypothetical genes in the GSS sequences were found with the GLIMMER. We found 22 clusters in GSS sequences that were not found in EST before, among others, Pyroglutamil-peptidase I, proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Peptidase_M8.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-17T17:59:45Z No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-17T17:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciencias Medicas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Anualmente, a malária afeta cerca de 300 milhões de pessoas no mundo (causando cerca de um milhão de mortes). No Brasil 450.000 casos são notificados anualmente. Recentemente, muitos trabalhos têm procurado identificar moléculas mediadoras da interação mosquito/plasmódio. Anopheles aquasalis é o vetor de malária mais importante nas regiões litorâneas do Brasil e Plasmodium vivax o agente etiológico causador da maior parte dos casos da doença. Este estudo visa examinar moléculas que participam da interação entre estes dois organismos. Para tal, duas estratégias foram utilizadas: subtração de cDNAs e PCR com iniciadores degenerados. As bibliotecas subtrativas foram produzidas a partir de amostras de A. aquasalis 2 e 24 horas após alimentação sanguínea ou infecção por P. vivax. Após a análise dos cDNAs obtidos foram observadas diferenças na expressão de genes entre A. aquasalis alimentados com sangue e com sangue infectado em ambos os intervalos de tempo investigados. Os resultados das subtrações de cDNA para os genes serino protease, fibrinogênio, proteína responsiva a bactéria e carboxipeptidase foram corroborados utilizando PCR em tempo real. Por exemplo, uma cecropina teve a sua expressão diminuída após a infecção com P. vivax e uma serpina apresentou um resultado oposto. Análise de um fator de transcrição GATA revelou um aumento de RNAm 36 horas após infecção com P. vivax assim como um aumento da infecção após silenciamento deste gene, demonstrando a importância deste fator de transcrição para a resposta imune do inseto contra P. vivax. Em paralelo, cDNAs de A. aquasalis específicos para genes relacionados com a via JAK-STAT [fator de transcrição STAT, proteína inibitória de STAT ativado (PIAS) e óxido nítrico sintase (NOS)] e com o sistema de detoxificação celular (catalase e duas superóxido dismutases) foram amplificados utilizando iniciadores degenerados. Resultados de expressão destes genes revelaram que STAT, PIAS e NOS são induzidos pela infecção com P. vivax e experimentos de genética reversa comprovaram que a via de sinalização JAK/STAT é importante na resposta imune do A. aquasalis contra este parasito. Com relação às enzimas de detoxificação, foi observado um aumento da expressão 36 horas após infecção e uma diminuição da atividade das enzimas SOD e catalase 24 horas após infecção. Este aumento de RNAm 36 horas após infecção pode estar relacionado à tentativa das células de diminuírem a quantidade intracelular de espécies reativas de oxigênio mantida pela diminuição da atividade destas enzimas 24 horas pós infecção. Surpreendentemente, o silenciamento da catalase exacerbou a infecção do P. vivax. Este resultado pode ser correlacionado com a produção de uma rede de ditirosina que protegeria os parasitos da resposta imune do inseto. Nossos resultados apontam mecanismos imunes adotados pelo A. aquasalis para combater o P. vivax, fornecendo informações importantes sobre moléculas envolvidas no processo de interação e imunidade deste vetor de malária no Brasil com seu parasito. / Each year, malaria affects 300 million people worldwide, causing 1 million deaths. In Brazil, 450,000 cases are reported annually. Recently, many studies have attempted to identify molecules that mediate the interaction mosquito-parasite. Anopheles aquasalis is the most important vector of malaria in the coastal regions of Brazil and the etiological agent Plasmodium vivax causes most cases of the disease. This study aims examining molecules that participate in the interaction between these two organisms. For this, two strategies were used: cDNA subtraction and PCR using degenerate primers. The subtractive libraries were produced from samples of A. aquasalis 2 and 24 hours after blood feeding or infection by P. vivax. After analyzes of cDNAs, differences were observed in gene expression between A. aquasalis fed with blood or infected blood at both times investigated. The expression of some candidates obtained through subtraction cDNA (serine protease, fibrinogen, carboxypeptidase and bacteria responsive protein genes) were confirmed using real time PCR. For example, the expression of a cecropin decreased after P. vivax infection while a serpin presented increased expression. Analysis of a transcription factor, GATA, revealed an increase in the mRNA levels 36 hours after infection. Silencing of this gene produced increased infection, demonstrating the importance of this transcription factor for the insect's immune response against P. vivax. In parallel, A. aquasalis cDNA sequences for the JAK-STAT pathway [transcription factor STAT, protein inhibitor of activated STAT (PIAS) and nitric oxide synthase (NOS)] and for genes related to cellular detoxification (catalase and two superoxide dismutases) were obtained using degenerate primers. Results of expression of these genes revealed that STAT, PIAS and NOS are induced by infection with P. vivax and reverse genetics experiments have shown that this pathway is important in the immune response of A. aquasalis against P. vivax. Regarding the detoxification enzymes, an increase in mRNA expression was observed 36 hours after infection and a decrease in activity 24 hours after infection. This increase in mRNA 36 hours after infection may be related to the attempt of cells to decrease the amount of intracellular ROS due to the diminished activity of these enzymes 24 hours after infection. Surprisingly, the silencing of catalase exacerbated the infection of P. vivax. This result may be correlated with the production of a dytirosine network that protects the parasites from the insect's immune response. Our results indicate immune mechanisms adopted by A. aquasalis to combat P. vivax, providing important information about molecules involved in the process of interaction and immunity of this vector with its Brazilian malaria parasite.