Made available in DSpace on 2016-01-07T13:36:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bianca_vitorio_ioc_mest_2014.pdf: 8997482 bytes, checksum: 58bdb04feb407967d076809db7227935 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / As diversas espécies de Leishmania são parasitas de considerável importância médica e econômica. As drogas atualmente utilizadas no tratamento da leishmaniose apresentam efeitos adversos, alta toxicidade, elevado custo e surgimento de cepas resistentes. Nesse contexto, inibidores proteolíticos é uma alternativa para o tratamento desta doença. Este estudo está focado nas calpaínas, que compreendem uma família de cisteína peptidases neutras dependentes de cálcio, envolvidas numa ampla variedade de funções fisiológicas. As calpaínas estão envolvidas em importantes doenças humanas, portanto inibidores de calpaínas já vêm sendo desenvolvidos e testados para o tratamento dessas doenças, alguns encontra-se em estágios avançados de triagem clínica. Dessa forma, o presente trabalho avalia a expressão e identificação de homólogos das calpaínas em Leishmania braziliensis e o efeito do inibidor de calpaínas MDL28170 em ensaios in vitro. Através da busca por sequências no GenBank, alinhamentos múltiplos, filogenia e análise de domínios conservados nas sequências obtidas, selecionamos como alvo inicial sequências de calpaínas que possuíam o maior número de domínios conservados. A análise da expressão gênica relativa indica que 13 das 20 calpaínas estudadas apresentam níveis constitutivos de mRNA nas formas procíclica e metacíclica de L. braziliensis. A expressão de cinco alvos é maior na forma procíclica, e a de um alvo é maior na forma metacíclica e há expressão estágio específica de apenas um alvo na forma procíclica. A partir de análises in silico, das sequências proteicas dessas calpaínas, selecionamos uma região consenso e um peptídeo correspondente a essa região foi sintetizado e empregado na imunização de coelhos A reatividade do anticorpo gerado (Anti-TryTrip CALPAIN) foi avaliada por Western blotting, citometria de fluxo e imunocitoquímica. Em ensaios de Western blotting,verificamos que o anticorpo foi capaz de reagir contra uma proteína de 50 kDa. Já na imunolocalização foi possível observar calpaínas dispersas no citoplasma, membrana e núcleo. Além disso, através de citometria de fluxo, as moléculas homólogas às calpaínas foram identificadas em maior abundância no interior das células. Nos ensaios de inibição com o MDL28170, inibidor de calpaínas, foi possível observar a redução da proliferação nas formas promastigotas recém isoladas e múltiplas passagens de forma dose-dependente nas diferentes concentrações do inibidor ao longo de quatro dias. O efeito reversíveldo inibidor também foi avaliado nas formas promastigotas, com taxas menores comparado com o controle. O efeito do inibidor, também foi capaz de diminuir de maneira dose-dependente o índice de associação e aumentou o percentual de células com parasitos aderidos durante o processo de interação com macrófagos peritoneais. O parasito aumentou a expressão de uma peptidse clássica (gp63) quando tratado com o MDL28170, já a expressão de calpaínas e cpb não foi alterada pelo estresse induzido pelo composto. Estes dados sugerem mais estudos para melhor caracterizar as calpaínas em L. braziliensis e sugerem uma maior avaliação para uma possível associação de moléculas similares as calpaínas com a virulência ou não do parasito. Assim este trabalho acrescenta novas possibilidades para a utilização de inibidores de calpaínas como um potencial alvo de desenvolvimento para o tratamento da leishmaniose / The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis. / The various species of Leishmania are parasites of considerable medical and economic importance. The drugs used in the treatment of leishmaniasis have adverse effects, high toxicity, high cost and emergence of resistant strains. In this context, proteolytic inhibitors could be an alternative for the treatment of this disease. This study is focused on calpains, which comprise a family of neutral cysteine peptidases, which are strictly dependent of calcium, and are there of known as Calcium Dependent Peptidases.These enzymes play a variety of physiological functions, and are involved in human diseases, therefore calpains inhibitors are under trial to treat these diseases. Thus, this study aimed to assess calpain expression levels in Leishmania braziliensis, as well as the effect of the calpain inhibitor MDL28170 in vitro. Through the searching for sequencesin GenBank, multiple alignments, and phylogenetic analysis of the obtained sequences conserved domains, selected as an initial target sequences of calpain which possessed the greatest number of conserved domains. In this sense, we assessed the expression levels of mRNA from a group of twenty sequences containing archetypal calpain domain. The analysis indicated that 13 out of the 20 studied calpains have constitutive levels of mRNA between the procyclic and metacyclic forms of L. braziliensis, while five calpains presented higher expression levels at the procyclic stage, and only one sequence is augmented at the metacyclic stage. One calpain molecule was found to be procyclic-specific. After that, we selected a consensus region and a peptide was synthesized and used to immunize rabbits. The reactivity of the antibody (anti-calpainTryTrip) was evaluated by Western blotting, flow cytometry and immunocytochemistry. In Western blotting assays, we found that the anti-calpain TriTryp antibody was able to recognize a 50 kDa protein. The immunolocalization assays revealed calpain molecules present at the membrane, nucleus and dispersed throughout the cytoplasm. Also, by flow cytometry, molecules homologous to calpains have been identified in abundance within cells. In inhibition assays employing MDL28170, a potent and specific calpain inhibitor, it was possible to observe a dose-dependent reduction in the proliferation rate, either in freshly isolated promastigotes or multiple passages parasites. MDL28170 presents a reversible inhibitory effect. The inhibitor was also able to decrease in a dose-dependent manner the association index and the percentage of host cells with attached parasites during the process of interaction with peritoneal macrophages. Finally, MDL28170 enhanced the expression of gp63 molecules, while cpb and calpains expression were not affect. Further studies to better characterize the calpain in L. braziliensis should be performed, aiming to add new possibilities for the exploitation of calpain inhibitors as a potential for the treatment of leishmaniasis.

Orientador: Marcelo Menossi Teixeira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-26T19:37:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maron_LyzaGontow_M.pdf: 2238825 bytes, checksum: 4a67ca7cb16ababccc6f8418622be2c0 (MD5) Previous issue date: 2000 / Mestrado

O intervalo post mortem (IPM) é o período de tempo que se passou desde a ocorrência do óbito até o momento em que se passa a estudar o corpo e/ou remanescente humano. A determinação deste intervalo é assunto de grande relevância no âmbito forense por seu papel importante na resolução de casos criminais. Existem diversas técnicas forenses para determinação do IPM, porém, em muitos casos são necessárias associações para melhores resultados. Na busca pela precisão, novos métodos são constantemente avaliados e testados, como a utilização da biologia molecular, na análise de moléculas de DNA e RNA. Estudos recentes vêm demonstrando o uso da molécula de RNA na determinação do IPM e, nesse sentido, os dentes são regiões do corpo indicadas para extração do RNA devido à presença do complexo dentino-pulpar que possui uma adequada disponibilidade de material genético e um elevado grau de proteção às condições endógenas e exógenas que podem acelerar a degradação da molécula. O objetivo deste estudo foi avaliar a aplicabilidade da utilização do método de quantificação da degradação do RNA extraído de polpas dentais como uma alternativa na determinação do IPM, simulando condições de inumação em terreno exposto as alterações de temperatura e umidade. Para isso, foram utilizados 70 dentes humanos divididos em 7 grupos, os quais foram submetidos à condição de inumação por períodos de tempo pré-estabelecidos. Posteriormente, os grupos foram exumados e procedeu-se a extração da polpa dental, extração da molécula de RNA e análise da degradação da molécula para obtenção dos resultados. Após as etapas descritas, foi possível constatar tecido pulpar para extração em 32,85% das amostras, sendo os grupos 1 e 4 aqueles com maior número de amostras com tecido pulpar aparente. Com relação à quantificação da integridade da molécula de RNA, dentre os 70 dentes que constituíam o grupo amostral total, o sistema Agilent 2100 Bioanalyzer (AgilentTM, Califórnia, Estados Unidos) só foi capaz de fornecer um RIN (número de integridade do RNA) para 11 amostras, o que corresponde a 15,71%. O grupo 1, foi o que apresentou o maior número de componentes com um RIN detectável, totalizando 40% e o Grupo 3,foi o que apresentou o maior RIN dentre um de seus representantes frente a todo grupo amostral, sendo este valor de 5.90. Nos grupos 6 e 7 não foi possível detectar nenhuma amostra com alguma taxa de integridade da molécula de RNA. Constatou-se que os resultados obtidos não foram suficientes para que fosse desenvolvida uma equação de regressão que fosse aplicável. Após a análise dos resultados, foi possível concluir que o método de quantificação da degradação da molécula de RNA extraída de polpas dentais não foi aplicável para estimativa do IPM em condições simuladas de inumação em terreno exposto as alterações de temperatura e umidade. / The post-mortem interval (PMI) is the period of time that has elapsed since the occurrence of death until the moment the body and/or human remains are studied. The PMI determination has great relevance in the Forensic Sciences for its important role in the resolution of criminal cases. There are several techniques for the PMI determination but associations are often necessary for better results. In the search for precision, new methods are constantly evaluated and tested, such as the use of molecular biology, through DNA and RNA analysis. Recent studies have demonstrated the use of the RNA molecule in the PMI determination. Teeth are important for RNA extraction because they have an adequate availability of genetic material and degree of protection against endogenous and exogenous conditions that can accelerate the molecule degradation. The aim of this study was to evaluate the applicability of the quantification method of the degradation of RNA extracted from dental pulps as an alternative in the determination of the post mortem interval, simulating inhumation conditions on exposed soil, with temperature and humidity changes. For this, 70 human teeth were divided into 7 groups, which were submitted to the inhumation condition for pre-established periods of time. Subsequently, the groups were recovered, and it was performed the dental pulp removal, RNA extraction and analysis of the degradation of the molecule to obtain the results. After the steps described, it was possible to verify pulp tissue for extraction in 32.85% of samples, with Groups 1 and 4 being those with the highest number of samples with apparent pulp tissue. Regarding the quantification of RNA molecule integrity, among the 70 teeth that made up the total sample group, the Agilent 2100 Bioanalyzer system (AgilentTM, California, USA) was only able to provide a RIN (RNA integrity number) for 11 samples, which corresponds to 15.71%. Group 1 presented the highest number of components with a detectable RIN, totaling 40% and Group 3, which presented the highest RIN among one of its representatives in relation to any sample group, being this value of 5.90. In groups 6 and 7 it was not possible to detect any sample with any integrity rate of the RNA molecule. It was found that the results obtained were not enough to develop a regression equation that was applicable and had baseline. After the analysis of the results, it was possible to conclude that the method of quantification of degradation of the RNA molecule extracted from dental pulps was not applicable to the estimation of the post mortem interval in simulated conditions of inhumation on exposed soil changes in temperature and humidity.

Os efeitos de ribonucleosídeos de guanina substituídos na posição C-8 na proliferação de linfócitos B estão bem documentados na literatura. Esses compostos são análogos de adutos formados pela adição de radicais livres a ribonucleosídeos e a RNA. Neste trabalho, verificamos as propriedades proliferativas de dois desses adutos, 8-metilguanosina (8-MeGuo) e 8-oxo-7 ,8-di-hidroguanosina (8-OxoGuo) e comparamos com 8-bromoguanosina (8-BrGuo), o composto mais estudado como indutor da proliferação de linfócitos B. 8-MeGuo e 8-OxoGuo foram sintetisados em rendimentos de 28 e 55%, respectivamente, e foram caracterizados por UV, NMR e CG-massa. Seus efeitos sobre a incorporação de timidina radioativa ([3H] TdR) no DNA de células de baço, fibroblasto 3T3(A31) e melanoma B16F10 foram examinados. Os dois adutos foram mitogênicos para células de baço mas foram seletivos quanto as células imortalizadas. 8-MeGuo atuou sobre células 3T3(A31) e 8-OxoGuo sobre as células de melanoma B16F10. O análogo não fisiológico 8-BrGuo foi efetivo em todas as células testadas. Experimentos de contagem de células, citotoxicidade e citometria de fluxo, indicaram que a síntese de DNA induzida pelas guanosinas substituídas na posição C-8 refletia crescimento celular. Foi proposto que os compostos agem de dentro da célula uma vez que seus efeitos são bloqueados em presença de um inibidor de transporte de nucleosídeo, mas não foram inibidos por um antagonista de receptor purinérgico. Os resultados obtidos, junto com os descritos na literatura, sugerem que no caso dos fibroblastos 3T3(A31) e células de baço de camundongo os efeitos proliferativos dos compostos não são dependentes do metabolismo desses compostos via salvação das purinas. No caso das células de melanoma, entretanto, os compostos parecem fazer parte do \"pool\" de nucleosídeos. A demonstração de que adutos produzidos por ataques radicalares em ribonucleosídeos e RNA são capazes de induzir proliferação celular, abre novas perspectivas para a compreensão do papel de radicais livres em processos carcinogênicos. / The ability of CS-substituted guanine ribonucleosides to induce B cell proliferation has been well documented in the literature. These compounds are analogues of adducts formed from free radical attack on ribonucleosides and RNA. Here we examined the proliferative properties of two of these radical adducts, 8-methylguanosine (8-MeGuo) and 8-oxo-7 ,8-dihydroguanosine (8-OxoGuo) and compared them with those of the well studied B cell mitogen, 8-bromoguanosine (8-BrGuo). 8-MeGuo and 8-OxoGuo were synthesized in yields of 28 and 55 %, respectively, and were characterized by UV, NMR and CG-MS. Their effects upon [3H] thymidine uptake by Swiss mice splenocytes, mouse embryo 3T3 (A31) fibroblasts and mouse B16F10 melanocytes were examined. Both guanosine radical adducts were shown to increase [3H] thymidine uptake by mice splenocytes but displayed selectivity in regard to continuous cell lines. 8-MeGuo acted upon 3T3(A31) fibroblasts whereas 8-OxoGuo acted upon B16F10 melanocytes. The non physiological analogue 8-BrGuo acted upon all tested cells. Parallel experiments of cell counting, cytotoxicity, and cell sorting indicated that DNA synthesis induced by the C8-substituted guanosines reflected cell growth. It is proposed that the compounds act intracellularly because their proliferative effects were blocked in the presence of a nucleoside transport inhibitor but were not inhibited by an antagonist of the A2 purine receptor. The obtained results, taken together with data from the literature suggest that in the case of 3T3 (A31) fibroblasts and mice splenocytes the proliferative effects of the compounds are not dependent on metabolism through purine salvage pathways. In the case of melanocytes, however, the compounds are likely to become part of the purine nucleoside pool. The demonstration that adducts produced by free radical attack on ribonucleosides and RNA are able to induce cell proliferation opens new perspectives for the understanding of free radical mediated carcinogenesis.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-05-25T16:16:51Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5635225 bytes, checksum: 95ddb52f9761379763555962c8aa641f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-25T16:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 5635225 bytes, checksum: 95ddb52f9761379763555962c8aa641f (MD5) Previous issue date: 2016-03-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neste trabalho, utilizando tres técnicas experimentais (pinoa optica, espalhamento di- namico de luz e calorimetria isotérmica de titulaoao), nés investigamos alguns ligantes que, além da intercalagao simples, apresentam outro mecanismo de interaoao com a molécula de DNA. Inicialmente, nos fizemos a caracterizaoao da molécula de DNA com dois ligantes: a Actinomicina D, que é um farmaco largamente utilizado em doen- Qas trofoblasticas gestacionais, tumor de Wilms e rabdomiossarcoma e o GelRed, um marcador de acidos nucléicos utilizado em experimentos de eletroforese. Utilizando dois modelos teoricos (o modelo estatistico de dois sitios e o modelo de exclusao de Vizinhos), foi possivel extrair os parametros fisico-quimicos das interaoo'es utilizando-se apenas os dados obtidos a partir dos experimentos de estiramento. Por liltimo, nos investigamos a interagao do DNA com dois ligantes (Brometo de Etidio e GelRed) em solugo'es contendo Poli(etileno glicol) 8000, a fim de estudarmos o comportamento do DNA em solugo'es contendo outras macromoléculas, simulando, de forma bastante simplificada, o meio no qual 0 DNA se encontra in viva. / In this work, by using three experimental techniques (optical tweezers, dynamic light scattering and isothermal titration calorimetry), we have investigated some ligands that, beside simple intercalation, have an additional mechanism of interaction with the DNA molecule. Firstly, we have performed the characterization of DNA molecule with two ligands: Actinomycin D, which is a drug widely used in gestational trophoblastic disease, Wilm’s tumor and rhabdomyosarcoma and GelRed, which is a fluorescent nucleic acid stain, used in electrophoresis technique. By using two theoretical models (quenched disorder statistical model and neighbor exclusion model), it was possible to extract some physicochemical parameters of the interaction from the data obtained by single molecule stretching experiments. Finally, we have investigated the interaction of the DNA molecule with two ligands (Ethidium Bromide and GelRed) in Poly(ethylene- glycol) 8000-rich solutions, in order to study the behavior of the DNA molecules in a crowd environment, mimicking, in a very simple way, the in viva environment.

Submitted by Luiz Felipe Barbosa (luiz.fbabreu2@ufpe.br) on 2015-04-17T12:53:01Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Annielle Silva.pdf: 4594171 bytes, checksum: 51d05b433109819b0c9846edafc2af58 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T12:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO Annielle Silva.pdf: 4594171 bytes, checksum: 51d05b433109819b0c9846edafc2af58 (MD5) Previous issue date: 2013-02-28 / CAPES CNPq INAMI / O nanoporo formado pela incorporação da α-hemolisina em bicamadas lipídicas planas é considerado modelo de nanoporo proteico para elucidação do mecanismo de transporte de moléculas e no desenvolvimento de dispositivos analíticos - biossensores, espectrômetros de massa e sequenciadores moleculares. O conhecimento da interação de nucleotídeos com o nanoporo da α-hemolisina é de especial interesse, pois, alguns estudos sugerem varias metodologias para a utilização deste nanoporo como sequenciador de DNA em tempo real. Apesar de todos os avanços, a principal dificuldade operacional para obtenção de um sequenciador baseado na tecnologia “nanopore sensing”, é a rapidez na translocação do DNA através do nanoporo; dificultando a discriminação adequada das bases. Neste contexto é imprescindível fazer adaptações moleculares no nanoporo visando o aumento do tempo de permanência do DNA e da energia de interação deste com o nanoporo. As principais estratégias disponíveis para produção de nanoporos adaptados são: mutações sítio dirigidas e funcionalização química. Ambas são de elevado custo e tempo de experimentação. Neste trabalho utilizamos técnicas de simulação computacional para obtenção, a nível atomístico, a interação do DNA com o nanoporo da α-hemolisina na sua forma nativa e adaptada em posições estratégicas previamente selecionadas por modelagem molecular. As técnicas utilizadas baseiam-se na dinâmica molecular fora do equilíbrio e na Relação de Jarzynski, na qual a média do trabalho realizado ao deslocar o DNA ao longo do nanoporo proteico é estatisticamente relacionada à energia livre do processo. As informações sobre as interações do DNA-nanoporo obtidas podem predizer, teoricamente, os nanoporos mais promissores para serem testados experimentalmente. Realizou-se a seleção das mutantes que foram usadas e foram obtidos dados importantes sobre a parametrização das dinâmicas usando a relação de Jarzynski, como velocidade e constante de força que devem ser aplicadas ao sistema. Além disso, foram obtidas informações sobre a trajetória e contato do DNA com o interior do poro mutado e na forma selvagem, o que mostra a efetividade do sistema.

Os efeitos de ribonucleosídeos de guanina substituídos na posição C-8 na proliferação de linfócitos B estão bem documentados na literatura. Esses compostos são análogos de adutos formados pela adição de radicais livres a ribonucleosídeos e a RNA. Neste trabalho, verificamos as propriedades proliferativas de dois desses adutos, 8-metilguanosina (8-MeGuo) e 8-oxo-7 ,8-di-hidroguanosina (8-OxoGuo) e comparamos com 8-bromoguanosina (8-BrGuo), o composto mais estudado como indutor da proliferação de linfócitos B. 8-MeGuo e 8-OxoGuo foram sintetisados em rendimentos de 28 e 55%, respectivamente, e foram caracterizados por UV, NMR e CG-massa. Seus efeitos sobre a incorporação de timidina radioativa ([3H] TdR) no DNA de células de baço, fibroblasto 3T3(A31) e melanoma B16F10 foram examinados. Os dois adutos foram mitogênicos para células de baço mas foram seletivos quanto as células imortalizadas. 8-MeGuo atuou sobre células 3T3(A31) e 8-OxoGuo sobre as células de melanoma B16F10. O análogo não fisiológico 8-BrGuo foi efetivo em todas as células testadas. Experimentos de contagem de células, citotoxicidade e citometria de fluxo, indicaram que a síntese de DNA induzida pelas guanosinas substituídas na posição C-8 refletia crescimento celular. Foi proposto que os compostos agem de dentro da célula uma vez que seus efeitos são bloqueados em presença de um inibidor de transporte de nucleosídeo, mas não foram inibidos por um antagonista de receptor purinérgico. Os resultados obtidos, junto com os descritos na literatura, sugerem que no caso dos fibroblastos 3T3(A31) e células de baço de camundongo os efeitos proliferativos dos compostos não são dependentes do metabolismo desses compostos via salvação das purinas. No caso das células de melanoma, entretanto, os compostos parecem fazer parte do \"pool\" de nucleosídeos. A demonstração de que adutos produzidos por ataques radicalares em ribonucleosídeos e RNA são capazes de induzir proliferação celular, abre novas perspectivas para a compreensão do papel de radicais livres em processos carcinogênicos. / The ability of CS-substituted guanine ribonucleosides to induce B cell proliferation has been well documented in the literature. These compounds are analogues of adducts formed from free radical attack on ribonucleosides and RNA. Here we examined the proliferative properties of two of these radical adducts, 8-methylguanosine (8-MeGuo) and 8-oxo-7 ,8-dihydroguanosine (8-OxoGuo) and compared them with those of the well studied B cell mitogen, 8-bromoguanosine (8-BrGuo). 8-MeGuo and 8-OxoGuo were synthesized in yields of 28 and 55 %, respectively, and were characterized by UV, NMR and CG-MS. Their effects upon [3H] thymidine uptake by Swiss mice splenocytes, mouse embryo 3T3 (A31) fibroblasts and mouse B16F10 melanocytes were examined. Both guanosine radical adducts were shown to increase [3H] thymidine uptake by mice splenocytes but displayed selectivity in regard to continuous cell lines. 8-MeGuo acted upon 3T3(A31) fibroblasts whereas 8-OxoGuo acted upon B16F10 melanocytes. The non physiological analogue 8-BrGuo acted upon all tested cells. Parallel experiments of cell counting, cytotoxicity, and cell sorting indicated that DNA synthesis induced by the C8-substituted guanosines reflected cell growth. It is proposed that the compounds act intracellularly because their proliferative effects were blocked in the presence of a nucleoside transport inhibitor but were not inhibited by an antagonist of the A2 purine receptor. The obtained results, taken together with data from the literature suggest that in the case of 3T3 (A31) fibroblasts and mice splenocytes the proliferative effects of the compounds are not dependent on metabolism through purine salvage pathways. In the case of melanocytes, however, the compounds are likely to become part of the purine nucleoside pool. The demonstration that adducts produced by free radical attack on ribonucleosides and RNA are able to induce cell proliferation opens new perspectives for the understanding of free radical mediated carcinogenesis.

Peroxinitrito (ONOO- + ONOOH), o produto da rápida reação do óxido nítrico com o ânion radical superóxido, tem recebido muita atenção como possível mediador dos efeitos deletérios associados a uma superprodução de •NO. O peroxinitrito é um potente oxidante que é capaz de oxidar e nitrar várias biomoléculas por mecanismos que contribuímos para esclarecer no decorrer desta tese. Especificamente, estudamos a oxidação de urato e tirosina por peroxinitrito. Demonstramos que o urato é oxidado por peroxinitrito a alantoina, aloxana e ao radical aminocarbonila. Como a reação direta entre urato e peroxinitrito tem uma constante de velocidade relativamente baixa (k= 4,8 x 102 M -1.s-1) em comparação com àquelas de outras biomoléculas, sugerimos que o urato é um potente sequestrador dos radicais derivados do peroxinitrito (•NO2 e CO3•-, na maioria dos ambientes biológicos; a pH ácido, o radical •OH também pode se tornar relevante). No caso da tirosina, confirmamos que ela não reage diretamente com o peroxinitrito mas com os radicais dele derivados. Como antecipado, o rendimento relativo dos produtos (3-nitrotirosina, 3,3-bitirosina e 3-hidroxitirosina (DOPA)) variou com o pH e a presença de CO2. Esses estudos nos levaram a propor a co-localização de proteínas nitradas e hidroxiladas como um possível biomarcador de peroxinitrito. Para testar essa hipótese, um anticorpo monoclonal anti-DOPA foi desenvolvido e utilizado em modelos de infecção por Leishmania amazonenses (macrófagos (J774), e camundongos resistentes (C56Bl/6) e suscetíveis (BALB/c). A co-localização de proteínas hidroxiladas e nitradas ficou evidênciada em todos os modelos testados e ocorreu concomitantemente a máxima produção de •NO. Infelizmente, o anticorpo obtido perdeu a atividade e ainda não pudemos confirmar esses dados. / Peroxynitrite (ONOO- + ONOOH), which is formed by the fast reaction between nitric oxide and superoxide anion, has been receiving increasing attention as a mediator of the deleterious effects associated with an overproduction of •NO. The compound is a strong oxidant that is able to oxidize and nitrate a variety of biotargets by mechanisms that this work has contributed to establish. Specifically, we studied the oxidation of urate and tyrosine by peroxynitrite. Urate oxidation produced allantoin, alloxan and the amiocarbonyl radical. Since the rate constant of the direct reaction between urate and peroxynitrite (k= 4,8 x 102 M-1.s-1) is low in comparison with those of other biotargets, we proposed that urate is an efficient scavenger of peroxynitrite-derived radicals (•NO2 and CO3•- in most biological environments; at acid pH, the •OH radical may also become relevant). ln the case of tyrosine, we confirmed that it does not react directly with peroxynitrite but, instead, with the radicals derived form it. As anticipated, the relative yield of the products (3-nitrotyrosine, 3,3-bityrosine and 3-hydroxytyrosine (DOPA)) varied with the pH and CO2 presence. These results led us to propose that co-localization of nitrated and hydroxylated proteins could be a peroxynitrite biomarker. To test this hypothesis, a monoclonal anti-DOPA antibody was developed and tested in Leishamnia amazonensis infection models (macrophages (J774), and resistant (C56Bl/6) and susceptible mice (BALB/c). It was possible to evidence co-localization of hydroxylated and nitrated proteins in all tested models in a time when •NO synthesis was maximum. Unfortunetly, we were unable to confirm these results due to antibody inactvation; new antibody baches are being obtained.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-14T13:46:13Z No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T13:46:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Este trabalho teve com objetivo o desenvolvimento e a validação/aplicação de um sistema integrado de genotipagem de protozoários, utilizando uma abordagem multidisciplinar envolvendo, PCR multiplex e análise bioinformática envolvendo evolução e filogenia molecular. Para isso, trinta e seis genes ortólogos universal (UOG) foram identificados e usados como marcadores para genotipagem de protozoários parasitas, a nível inter-específico. Temos extraído os dados genéticos de genes ortólogos universal selecionado. Para isso, estamos utilizando sequências de grupos ortólogos (COG e KOG). O COG é composto de genes ortólogos individuais ou grupos de ortólogos de parálogos de 3 ou mais linhagens filogenéticas. Os COG de interesse selecionados estão envolvidos processo de tradução protéica, categoria J do COG, e estes genes foram selecionados porque eles estão presentes em todos os organismos estudados até agora, o que facilita a montagem de um sistema integrado de protozoários patogênicos. As sequências desses genes foram obtidos a partir do banco de dados GenBank. Seqüências de espécies de Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum e P. vivax foram obtidas e armazenadas localmente. Estas sequências nucleotídicas foram traduzidas em proteínas, e então validadas usando a ferramenta COGnitor/KOGnitor, que mostra a sequência selecionada pertence ao respectivo COG de interesse. Após essa validação, as sequências foram utilizadas nos alinhamentos e construção de iniciadores que foram usados para gerar fragmentos gênicos amplificados por PCR. Os programas para a construção dos iniciadores foram: Mafft para a construção de alinhamentos múltiplos de cada COG, JalView para visualizá-los e o programa Primer3 para o desenho dos iniciadores. Todo o processo foi realizado por um pipeline de integração destes programas escritos em linguagem de programação Perl. Após o processo automatizado de validação, alinhamento e construção dos iniciadores, realizamos uma análise final dos iniciadores, considerando suas características e da região de pareamento. Quando necessário, definiu-se manualmente a degeneração da posição dos nucleotídeos que contem a variação. Criamos 33 pares de iniciadores, que foram utilizados para a amplificação destes genes via PCR. As reações de amplificação da PCR fora bem-sucedida em 19 UOG nas espécies Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax e Plasmodium vivax, utilizando-se iniciadores com posições degeneradas. Para genotipagem das seqüências geradas pela PCR, foi utilizado o programa Phred que realizou a leitura dos cromatogramas com qualidade por base, Phred ≥ 15, e o programa Blast foi utilizado para a caracterização das sequências geradas, estas duas etapas foram realizadas em pipeline de anotação que está disponível através de um website. As árvores filogenéticas foram geradas com o método de máxima verossimilhança utilizando o pipeline ARPA, e revelou que a metodologia apresenta potencial para ser utilizado na genotipagem destes organismos e os genes da metionil-tRNA sintetase e Seril-tRNA sintetase mostraram boa resolução para a genotipagem inter-específicas de tripanosomatídeos. / The aim of this work is to develop and validate an integrated genotyping system for protozoan parasites, using a multidisciplinary approach involving, multiplex PCR, and bioinformatics analysis involving molecular evolution and phylogeny. For this, thirty three universal orthologous genes (UOG) has been identified [1] and used as markers for genotyping parasitic protozoan at the intraspecific level. We have mined genomic data of universal orthologous genes selected. For this, we are using sequences of orthologous groups (COGs and KOGs). The COG's consists of individual orthologous genes or orthologous groups of paralogous of 3 or more phylogenetic lineages. The selected COGs of interest are involved protein translation process, category J of the COG and these genes are selected because they are present in all organisms studied so far, facilitating the assembly of an integrated system for the pathogenic protozoa. Note that all these genes are part of the process of protein translation. The sequences of these genes were obtained from GenBank database. Sequences of species, Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum and P. vivax were obtained and locally stored. Nucleotide sequences were translated into proteins. So, they are validated using the Blast similarity tool and the database as the COG itself, which shows the sequence selected belongs to the respective COG. After this validation, the sequences were used in alignments and construction of primers that are used to generate amplicons by PCR. The programs for the primer construction were: Mafft for construction of multiple alignments of each COG, JalView to view them and the program Primer3Plus [6] for the design of primers. The whole process was performed by a pipeline integrating these programs written in Perl [7] programming language. After the automated process of validation, alignment and construction of the primers, we perform a final analysis of the primers manually, which gives its characteristics and the annealing region. When necessary, we manually define the degeneration of nucleotide position containing variations. We have designed 33 primer pairs, and these primers were designed and used for PCR amplification. The reactions of PCR amplification was successful for 19 UOG in species: Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax and Plasmodium vivax, using primers with degenerate positions. For genotyping the sequences generates by PCR amplification was used the program Phred for reading chromatograms file with quality ≥ 15, and Blast to the characterization of sequences generated, this two steps was make with a pipeline and is available through a website. The phylogenetic trees was generated with methods of maximum likelihood using the pipeline ARPA, and revealed that the methodology has potential to be used in genotyping of these organisms, and genes of methionyl-tRNA synthetase, seryl- tRNA synthetase showed good resolution for the inter-specific genotyping of trypanosomatids.

Made available in DSpace on 2016-03-18T12:15:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marcia_bezerra_ioc_dout_2012.pdf: 3641805 bytes, checksum: 551d726828aba255caeef4c323eae9ee (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Esta tese descreve o projeto conceitual do sistema de banco de dados ProteinWorldDB (PWDB). Um ponto importante da proposta do PWDB é permitir a construção de consultas e procedimentos no domínio da genômica comparativa sem a necessidade de comparação de sequências. Além disso, o PCG comparou milhões de sequências de proteína, incluindo o conjunto proteico total de centenas de genomas completos, utilizando programação dinâmica, e não um método heurístico, para os cálculos de similaridade. A estratégia do PCG, assim como a genômica, está fundamentada no conhecimento de que sequências biológicas por si só são pouco informativas; elas precisam ser analisadas a partir de um enfoque comparativo para a inferência de homologia. A comparação de sequências de diferentes organismos introduz uma perspectiva evolutiva ao processo, e o estudo comparativo de genomas completos pode ampliar a escala do conhecimento de um único processo biológico para o de sistemas biológicos complexos em células e organismos. Para responder eficientemente questões dessa natureza, o esquema conceitual apresentado associa bases de dados biológicos de referência aos índices de similaridade já pré-calculados e armazenados pelo PCG Utilizando um formato gráfico de fácil compreensão para representar conceitos e relacionamentos (diagrama ER), o esquema foi proposto para facilitar o planejamento de consultas e procedimentos por pesquisadores da área de genômica (sem conhecimento de linguagens de bancos de dados), assim como guiar o desenvolvimento e a implementação física do PWDB por profissionais da área de computação. Alguns exemplos são apresentados com o objetivo de demonstrar a utilização do esquema conceitual para a especificação de consultas e procedimentos, mesmo antes da existência de um esquema lógico. O esquema pode ser facilmente estendido. Módulos anexos podem ser inseridos/removidos para incluir outros projetos, baseados em comparação de sequências de proteína, que se beneficiem das informações fornecidas pelo módulo central do esquema e novas bases de dados, específicas de diferentes áreas (-ômicas, por exemplo), podem ser integradas ao esquema / This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema / This thesis describes the conceptua l design of the database system ProteinWorldDB (PWDB) . An important point of the PWDB p roposal is to allow the construction of queries and procedures in the field of comparative genomics without the need for sequence comparison . Moreover , the PCG compared millions of protein sequences, including the entire set of proteins from hundreds of complete genomes using dynamic programming , rather than a heuristic method , for calculating similarity PCG‘s strategy, like that of genomic studies in general, is grounded in the knowledge that biological sequences alone are uninformative. They need to be analyzed from a comparative approach to infer homology. The comparison of sequences from different organisms introduces an evolutionary perspective to the process and the comparative study of complete genomes can expand our knowledge from a single biological process all the way to complex biological systems in cells and organisms. To efficiently answer questions of this nature, the conceptual schema links selected internati onal reference biological databases to similarity indexes already precomputed and stored by the PCG . By using an easily understandable graphic format to represent concepts and relationships (ER diagram), the schema was proposed to help the design of querie s and procedures by genomic researchers (who may not have knowledge of database languages) as well as to guide the development and physical implementation of the system by developers. Some e xamples are presented to demonstrate the use of the conceptual sch ema for specifying queries and procedures, even before the existence of a logical schema. The schema can be easily extended. Additional modules can be inserted/removed to include other protein sequences comparisons projects that may benefit from the inform ation provided by the schema ́s central module. Likewise, new databases specific to different areas ( - omics, for example) can be cross - referenced to the schema