Η αιμοποιητική φωλαιά (hematopoietic stem cell niche) περιέχει οστεοβλάστες, οι οποίοι
ρυθμίζουν τη φυσιολογική αιμοποίηση. Ωστόσο, λίγα στοιχεία είναι γνωστά, έως τώρα, για το
ρόλο των οστεοβλαστών στη διαδικασία της αιμοποίησης σε ασθενείς με Μυελοδυσπλαστικό
Σύνδρομο (ΜΔΣ). Το ΜΔΣ, αποτελεί μια ετερογενή ομάδα κλωνικών αιματολογικών
διαταραχών, με αυξημένο κίνδυνο εκτροπής προς Οξεία Μυελογενή Λευχαιμία (ΟΜΛ).
Μελέτες σε ex-vivo συστήματα καλλιεργειών (co-cultures) περιγράφουν την επίδραση των
μεσεγχυματικών κυττάρων (“feeder cells”) στο δυναμικό πολλαπλασιασμού, στη
μεταναστευτική ικανότητα, καθώς και στη διατήρηση (stemness) των αρχέγονων
αιμοποιητικών κυττάρων (HSCs) φυσιολογικών δοτών. Η μελέτη αυτή στοχεύει στη
διερεύνηση των βιολογικών χαρακτηριστικών των οστεοβλαστών από ασθενείς με ΜΔΣ
καθώς και τις αλληλεπιδράσεις φυσιολογικών HSCs και οστεοβλαστών ασθενών με ΜΔΣ. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκε ένα σύστημα δισδιάστατης καλλιέργειας (2-D culture
system) χρησιμοποιώντας οστεοβλάστες που παρήχθησαν από μεσεγχυματικά κύτταρα
μυελού των οστών (human marrow mesenchymal stem cells-MSCs). Τα MSCs
απομονώθηκαν από το μυελό των οστών ασθενών με ΜΔΣ και υγιών δοτών και
καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλο θρεπτικό μέσο. Ακολούθησε επαγωγή της διαφοροποίησης
των MSCs, μετά από συνεχόμενες καλλιέργειες σε οστεοβλάστες. Στη μελέτη
χρησιμοποιήθηκαν 13 δείγματα μυελού των οστών από ασθενείς με ΜΔΣ (6 RA, 3 RAEBI, 2
RAEBII, 1 5q- και 1 υποπλαστικό MDS) και 8 δείγματα μυελού φυσιολογικών μαρτύρων
όμοιας ηλικίας. Για τη μελέτη της επίδρασης των οστεοβλαστών από ασθενείς με ΜΔΣ στην
αιμοποίηση χρησιμοποιήθηκαν φυσιολογικά HSCs από κινητοποιημένο περιφερικό αίμα
υγιών δοτών (mPB, n=4), τα οποία τοποθετήθηκαν πάνω στους ήδη εγκατεστημένους
οστεοβλάστες (osteoblast confluent monolayer cultures). Τα MSCs και οι οστεοβλάστες που
αναπτύχθηκαν ελέγχθηκαν μορφολογικά και ανοσοφαινοτυπικά, με τη χρήση μικροσκοπίας
και κυτταρομετρίας ροής αντίστοιχα. Μονοπύρηνα κύτταρα από δείγματα κινητοποιημένου
περιφερικού αίματος υγιών δοτών τοποθετήθηκαν στο δισδιάστατο καλλιεργητικό σύστημα,
σε καλλιεργητικό υλικό αιμοποιητικών κυττάρων, χωρίς την εξωγενή προσθήκη κυτταροκινών.
Με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής ελέγχθηκε η έκφραση των μορίων που σχετίζονται με την
προσκόλληση των αιμοποιητικών κυττάρων στην αιμοποιητική φωλαιά καθώς και την
εγκατάσταση και διατήρησή τους σε αυτή. Ο έλεγχος έγινε στις 36 ώρες και τις 7 ημέρες
συγκαλλιέργειας και αφορούσε τα μόρια CXCR4, το οποίο ρυθμίζει την άμεση πρόσδεση των
HSCs στην φωλαιά κατά τη διαδικασία του “homing”, CD49d (Very Late Antigen-4- VLA4) και
CD49e (Very Late Antigen-5- VLA5), τα οποία παρέχουν σήματα επιβίωσης ή προάγουν την
ενεργοποίηση μιας φάσης ηρεμίας (quiescence) στα HSCs μετά την είσοδο τους στη φωλαιά
(localization). Η έκφραση των μορίων αυτών μελετήθηκε στους υποπληθυσμούς των CD34+,
CD34+/CD38+ και CD34+/CD38- κυττάρων. Παράλληλα εκτιμήθηκε το ποσοστό (συχνότητα)
των CD34+ αιμοποιητικών κυττάρων καθώς επίσης και η προσκόλλησή τους στους
οστεοβλάστες. Μετά τη συγκαλλιέργεια, οι οστεοβλάστες που προήλθαν από υγιείς δότες προκάλεσαν τον
πολλαπλασιασμό των CD34+ κυττάρων των φυσιολογικών αιμοποιητικών κυττάρων που
τοποθετήθηκαν πάνω στο εγκατεστημένο στρώμα των οστεοβλαστών (3-fold και 9-fold
αύξηση στις 36ώρες και τις 7ημ., αντίστοιχα). Αύξηση επίσης, παρατηρήθηκε (2 fold αύξηση)
στα CD34+ κύτταρα στις συγκαλλιέργειες των 36h, φυσιολογικών HSCs με οστεοβλάστες που
παρήχθησαν από ασθενείς με ΜΔΣ, ενώ καμία διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ των
διαφορετικών υποτύπων ΜΔΣ. Στις 7 ημέρες συγκαλλιέργειας από την άλλη, δεν
12
παρατηρήθηκε καμία διαφορά στη συχνότητα εμφάνισης ενός πιο άωρου φαινοτύπου των
φυσιολογικών HSCs που αναπτύχθηκαν σε οστεοβλάστες από ασθενείς με χαμηλού κινδύνου
ΜΔΣ (low risk MDS). Αντιθέτως, τα CD34+ κύτταρα αυξήθηκαν κατά πολύ (16- fold αύξηση),
όταν φυσιολογικά HSCs, τοποθετήθηκαν σε οστεοβλάστες ασθενών με υψηλού κινδύνου
ΜΔΣ (high risk MDS). Επιπλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης των μορίων CXCR4,
CD49d και CD49e στα CD34+ κύτταρα μετά από συγκαλλιέργεια φυσιολογικών HSCs και
οστεοβλαστών από υγιείς δότες, συγκριτικά με τα επίπεδα έκφρασης των μορίων αυτών πριν
την τοποθέτηση τους στο σύστημα συγκαλλιέργειας. Η αύξηση της έκφρασης του μορίου
CXCR4 ήταν λιγότερο εμφανής στην περίπτωση συγκαλλιέργειας των φυσιολογικών HSCs με
οστεοβλάστες από ασθενείς με ΜΔΣ, όπου η μεγαλύτερη διαφορά παρατηρήθηκε στο
σύστημα που περιείχε τους οστεοβλάστες από ασθενείς χαμηλού κινδύνου ΜΔΣ (3- και 1,7-
fold αύξηση στις 7ημέρες καλλιέργειας με οστεοβλάστες από υγιείς δότες και χαμηλού
κινδύνου ΜΔΣ ασθενείς, αντίστοιχα). Το πρότυπο έκφρασης των μορίων CD49d και CD49e
ήταν όμοιο στα κύτταρα που τοποθετήθηκαν τόσο σε οστεοβλάστες προερχόμενους από
υγιείς δότες, όσο και οστεοβλάστες από ΜΔΣ ασθενείς. Ο φαινότυπος, τόσο όσον αφορά τα μορφολογικά όσο και τα ανοσοφαινοτυπικά
χαρακτηριστικά, των MSCs ήταν ίδιος και στις δυο ομάδες μελέτης, ενώ η διαφοροποίηση
των MSCs προς οστεοβλάστες ήταν όμοια τόσο στα MSCs που προήλθαν από
φυσιολογικούς δότες όσο και σε αυτά που προήλθαν από ασθενείς με ΜΔΣ, δείχνοντας
παρόμοια έκφραση των ειδικών οστεοβλαστικών πρωτεϊνών αλλά και της διαδικασίας της
ενασβεστοποίησης. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα που λάβαμε, οι οστεοβλάστες από υγιείς
δότες προώθησαν την αύξηση του ποσοστού των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων και
οδήγησαν στην επαγωγή της έκφρασης του μορίου CXCR4, ενός πολύ σημαντικού μορίου
για τη μετανάστευση, την εγκατάσταση αλλά και την ανάπτυξη. Ωστόσο, η διαφορετική
δραστηριότητα, τόσο όσον αφορά το ποσοστό των CD34+ όσο και την έκφραση του μορίου
CXCR4, όταν τα φυσιολογικά αιμοποιητικά κύτταρα συγκαλλιεργήθαν με οστεοβλάστες που
προήλθαν από ασθενείς με ΜΔΣ, οδηγεί στην υπόθεση ότι υπάρχει μεταβολή στη λειτουργία
των οστεοβλαστών, οπότε προβλέπεται και μια επακόλουθη αλλαγή στη ρύθμιση της
εγκατάστασης των HSC στην αιμοποιητική φωλαιά, στους ασθενείς με ΜΔΣ. / The hematopoietic stem cell niche contains osteoblasts that regulate normal hematopoiesis.
However, little is known about the role of osteoblasts in MDS hematopoiesis so far.
Myelodysplastic syndrome comprises a heterogeneous group of clonal stem cell disorders
with dismal prognosis and difficulty in their therapeutic approach, which is characterized by
ineffective hematopoiesis. It appears with dysplastic hematopoietic cells, peripheral blood
cytopenias and high risk of evolution to acute myeloid leukemia (AML). Data derived from ex
vivo co-culture systems using mesenchymal stromal cells as a feeder cell layer suggest that
cell-cell contact has a significant impact on the expansion, migratory potential and “stemness”
of hematopoietic stem cells. In this study, we investigated the biological characteristics of
osteoblasts from MDS patients and the interactions between these cells and normal
hematopoietic stem cells (HSCs). Osteoblasts were differentiated from marrow MSCs from 13 MDS patients (6 RA, 3 RAEBI, 2
RAEBII, 1 5q- and 1 hypoplastic MDS) and 8 age-matched healthy individuals. To study the
effect of MDS osteoblasts on hematopoiesis, normal HSCs from mobilized peripheral blood
from healthy individuals (n=4) were seeded onto osteoblast confluent monolayer cultures
using a culture medium appropriate for the culture of HSCs, without the exogenous addition of
cytokines. We studied the morphology and immunophenotype of MSCs and osteoblasts by
microscopy and flow cytometric analysis, respectively. Cytometric analyses of homing
associated molecules were performed 36h and 7d later. These molecules are CXCR4, which
regulates the direct adhesion of HSCs to the bone marrow niche during “homing”, CD49d
(Very Late Antigen-4- VLA4) and CD49e (Very Late Antigen-5- VLA5), which produce survival
signals or promote the maintenance of a quiescent state for HSCs after entering the stem cell
niche (localization). We investigated the expression of these molecules in CD34+,
CD34+/CD38+ and CD34+/CD38- cell populations. Furthermore we studied the frequency of
CD34+ hematopoietic cells and also their ability to adhere osteoblasts.Osteoblasts from healthy individuals increased the frequency of CD34+ cells by 3- and 9-fold
increase in normal hematopoietic cells after 36h and 7d co-cultures respectively. A 2-fold
increase was also seen in CD34+ cells when normal HSCs grown on MDS-osteoblasts for 36h
and no difference was seen between the MDS subtypes. When the culture period was
extended to 7d, there was no change in the frequency of immature phenotype of normal
HSCs in osteoblast cultures from low-risk MDS patients. In contrast, CD34+ cells increased
several fold (16-fold increase) when normal HSCs were cultured on high-risk MDS
14
osteoblasts, twice the values obtained in osteoblast co-cultures from healthy individuals and
low risk patients. The expression of adhesion molecules CXCR4, CD49d and CD49e on
CD34+ cells from normal HSCs was increased in co-cultures with osteoblasts from healthy
individuals compared to the values obtained before culture (3-fold increase at 7d). The
increase in CXCR4 expression was less pronounced in the presence of osteoblasts from
MDS patients with the largest difference being found in low-risk MDS patients (1,7-fold
increase at 7d). The expression pattern of CD49d and CD49e was identical between cells
grown on MDS- and normal- osteoblast co-cultures.The morphological and immunophenotypical analysis of MSCs show the same results for the
two study groups, while the differentiation of MSCs to osteoblasts was similar for both healthy
individuals and MDS patients, after having similar expression of bone specific proteins and
mineralization activity. According to our data, osteoblasts from healthy individuals promoted
the expansion of immature hematopoietic progenitors and induced the cell surface expression
of CXCR4, an important molecule in HSCs homing, retention and development. However, the
different expression of CXCR4 and the change in frequency of CD34+ cells that were
detected when normal HSCs co-operated with MDS-osteoblasts, suggests alteration in
osteoblast function and the subsequent regulation of the HSC residency in the niche in MDS
patients compared with healthy individuals.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/5265 |
| Date | 30 May 2012 |
| Creators | Καλυβιώτη, Ελένη |
| Contributors | Μουζάκη, Αθανασία, Kalivioti, Eleni, Μουζάκη, Αθανασία, Καρακάντζα, Μαρίνα, Παπαχρήστου, Διονύσιος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.004 seconds