Η παρούσα εργασία είχε ως αντικείμενο, αρχικά, τη δημιουργία υβριδικών μορφών της πρωτεΐνης Geminin- ενός αρνητικού ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου- με το φθορίζον μόριο GFP (Green Fluorescent Protein). Πραγματοποιήθηκε τόσο αμινοτελική όσο και καρβοξυτελική σύντηξη της Geminin με το μόριο-ιχνηθέτη, έτσι ώστε να μελετηθεί η συμπεριφορά του νέου, υβριδικού μορίου και στις δύο περιπτώσεις και να εξεταστεί εάν ο προσανατολισμός της GFP πρωτεΐνης δύναται να μεταβάλλει το χαρακτήρα της σημασμένης πρωτεΐνης. Ακολούθησε ανίχνευση και παρακολούθηση καθενός υβριδικού μορίου σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μετά από διαμόλυνση για μικρό (παροδική διαμόλυνση διάρκειας 22 ωρών) ή μεγαλύτερο χρονικό διάστημα (σταθερά διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές). Ο χαρακτηρισμός των φθοριζουσών μορφών της Geminin περιελάμβανε μελέτη τόσο του υποκυτταρικού εντοπισμού όσο και της χρονικής έκφρασης των μορίων και σύγκριση με τα αντίστοιχα χαρακτηριστικά του ενδογενούς μορίου. Ανάλυση του ενδοκυτταρικού εντοπισμού τόσο της καρβοξυτελικής όσο και της αμινοτελικής σύντηξης της Geminin με τη GFP, αποκάλυψε, εκτός του πυρηνικού φαινοτύπου, που παρατηρείται φυσιολογικά για το ενδογενές μόριο, σημαντικό ποσοστό παροδικά διαμολυσμένων κυττάρων με τα υβριδικά μόρια εκτός του πυρηνικού διαμερίσματος. Ο φαινότυπος αυτός εμφανίζεται – σε μικρότερο ποσοστό- ακόμη και στην περίπτωση σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων, όπου τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin-GFP είναι παρόμοια με τα αντίστοιχα του ενδογενούς μορίου. Στη σειρά αυτή, το μεγαλύτερο ποσοστό κυττάρων, παρά την ισχυρή μεταγραφική δραστηριότητα που προσδίδει ο CMV υποκινητής, εκφράζει το εξωγενές μόριο σύμφωνα με το πρότυπο που παρουσιάζει η ενδογενής Geminin, δηλαδή κατά τις φάσεις S και G1. Επομένως, η ρύθμιση της Geminin-GFP υβριδικής πρωτεΐνης πραγματοποιείται σε μεγάλο βαθμό σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η αλλαγή στην ενδοκυτταρική κατανομή του υβριδικού μορίου δεν παρουσιάζει τυχαία χρονική εμφάνιση. Το γεγονός ότι εμφανίζεται αποκλειστικά σε αρνητικά για κυκλίνη Α κύτταρα, φανερώνει την ύπαρξη συσχέτισης με τη φάση του κυτταρικού κύκλου και μάλιστα υποδηλώνει την επιλεκτική έξοδό της από τον πυρήνα κατά τη φάση G1. Πιθανόν, η έξοδος της Geminin από τον πυρήνα κατά τη φάση αυτή, να διασφαλίζει τη διεκπεραίωση της διαδικασίας της αδειοδότησης του γενετικού υλικού –αναστολέας της oποίας είναι η Geminin και κατ’ επέκταση την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου Το φαινόμενο αυτό χρήζει περαιτέρω διερεύνησης μιας και η αλλαγή στην ενδοκυτταρική κατανομή πολλών ρυθμιστικών μορίων αποτελεί έναν αποδοτικό τρόπο ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, ενώ παράλληλα φαίνεται να επηρεάζει πολλές ζωτικής σημασίας λειτουργίες. / The aim of the present study was the construction of fused forms of Geminin- a negative cell cycle regulator-with GFP (Green Fluorescent Protein). Amino- and carboxy terminal fusions of Geminin and GFP were performed, in order to study the behaviour of the hybrid molecule in both cases and to examine if the orientation of the reporter gene can interfere with the character of the new molecule. Each fused molecule was either transiently or stably transfected in human cancer cells and its behaviour was studied. The characterization of the fluorescent molecules of Geminin was performed at the level of subcellular localization and regulation throughout the cell cycle and was compared to the endogenous characteristics. Analysis of the subcellular distribution of both fused forms, revealed -apart from the nuclear phenotype, normally observed- a significant percentage of transiently transfected cells, where the hybrid molecules were excluded from the nucleus. This phenotype was observed- though less strongly- in the case of stably transfected cells, where the expression levels of Geminin-GFP protein are similar to the endogenous molecule. The majority of these cells, despite the strong CMV driven transcriptional activity, express Geminin-GFP during S and G1 phase, like the endogenous protein, suggesting that the regulation of Geminin-GFP is performed mainly at post-transcriptional level. This nuclear exclusion was observed according to a cell cycle- dependent manner. The phenomenon of nucleocytoplasmic shuttling of many proteins seems to be a very efficient way of controlling gene expression in eukaryotes. In order to elucidate the role of sucellular distribution of Geminin-GFP in cell cycle regulation, further examination of this phenomenon is needed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/436 |
| Date | 29 June 2007 |
| Creators | Δημάκη, Μαρία |
| Contributors | Λυγερού, Ζωή, Dimaki, Maria, Λυγερού, Ζωή, Αθανασιάδου, Αγλαϊα, Καλπαξής, Δημήτριος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0027 seconds