Η ισορροπία μεταξύ κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικής διαφοροποίησης
είναι εξέχουσας σημασίας κατά την ανάπτυξη των πολυκύτταρων οργανισμών.
Κεντρικοί ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου έχει δειχθεί να συμμετέχουν και σε
διαδικασίες κυτταρικής διαφοροποίησης, όπως η οικογένεια των E2F μεταγραφικών
παραγόντων, το pRb και οι αναστολείς των κυκλινοεξατώμενων κινασών (CKIs). H
Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο τόσο στον κυτταρικό κύκλο όσο και στην
ανάπτυξη, η οποία έχει προταθεί σαν ένας πιθανός ρυθμιστής αυτών των
διαδικασιών. H Geminin εμφανίζει διαφορετικές δράσεις, αλληλεπιδρώντας με ένα
σημαντικό αριθμό κυτταρικών παραγόντων. Σε αυτές τις αλληλεπιδράσεις σημαντικό
ρόλο παίζει η περιοχή του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin.
Πρόσφατα, μέσω βιοπληροφορικών αναλύσεων βρέθηκε ένας γενετικός τόπος στο
ανθρώπινο γονιδίωμα ο οποίος κωδικοποιεί για μία πρωτεϊνική αλληλουχία με
σημαντική ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα της Geminin. H πρωτεΐνη αυτή
ονομάστηκε Castor.
Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν εργαλεία βιοπληροφορικής, για την
ανάλυση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας του Castor και τη σύγκριση αυτής με την
Geminin.
Στη συνέχεια, μελετήθηκε με την μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης η αλληλεπίδραση
της πρωτεΐνης Castor με τη Geminin και ο ομοδιμερισμός του Castor και
χαρτογραφήθηκαν οι περιοχές που ευθύνονται για τις αλληλεπιδράσεις αυτές.. Ο
Castor σχηματίζει σύμπλοκο με την Geminin και η αλληλεπίδραση αυτή απαιτεί το
σπειροειδές σπείραμα της Geminin και τα 254 καρβοξυτελικά αμινοξέα του Castor,
στα οποία περιέχεται το σπειροειδές σπείραμα του. Τα τελευταία 254 αμινοξέα είναι
υπεύθυνα και για τον ομοδιμερισμό του μορίου. Σύγκριση της ισχύος
αλληλεπιδράσεων έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ Castor και Geminin είναι
ισχυρότερη από τον ομοδιμερισμό του Castor, αφού η Geminin δύναται να
ανταγωνιστεί την πρόσδεση του Castor στον εαυτό του.
Τέλος, αναπτύχθηκαν μοριακά εργαλεία απαραίτητα για τη μελέτη του Castor. To
πρώτο αφορά την παραγωγή και καθαρισμό πολυκλωνικού αντισώματος κατά
αμινοτελικού τμήματος της Castor πρωτεΐνης. Η ειδικότητα του αντισώματος
ελέγχθηκε με ανοσοτύπωση Western. To αντίσωμα είναι λειτουργικό αφού
αναγνωρίζει την εξωγενή πρωτεΐνη CastorGFP ενώ δεν μπορούν να εξαχθούν ασφαλή
συμπεράσματα για την ενδογενή ανθρώπινη πρωτεΐνη. Το δεύτερο αφορά την
7
ανάπτυξη της μεθοδολογίας RNAi για την αποσιώπηση του γονιδίου του Castor σε
κυτταρικές σειρές. Η λειτουργικότητα του RNAi ελέγχθηκε τόσο σε ανοσοτύπωση
Western όσο και σε ανοσοφθορισμό σε σταθερά διαμολυσμένη με CastorGFP
κυτταρική σειρά και είναι λειτουργικό. Τα παραπάνω εργαλεία είναι απαραίτητα για
μελλοντικές λειτουργικές μελέτες του Castor. / Τhe coordination of cellular proliferation and differentiation is of critical importance
for the development of multicellular organisms. Cell cycle regulators have been
shown to participate in the regulation of these two processes, such as E2F
transcriptional factors family, pRb and Cdk inhibitors (CKIs). Geminin is a
bifunctional protein participating in cell cycle regulation and in developmental
processes and has been proposed as a candidate for the regulation of these two
processes. Geminin balanced interactions with various binding partners are central to
its different function. In these interactions the coiled coil of Geminin plays an
important role not only as a binding interface but also maintaining the structural
integrity of the molecule. Recently in silico analysis has revealed a new genetic locus
in the human genome that codes for a protein with significant homology to the
Geminin coiled coil region. This protein is named Castor.
In this study, in silico analysis was performed to examine the expression of the
molecule by analyzing the available ESTs, sequence analysis of Castor protein and
comparison to Geminin structural and functional motifs.
.
We also studied the molecular interaction between Geminin and Castor and Castror
homodimerization. We show that Geminin formes a complex with Castor.The coiled
coil of Geminin is required for the interaction. Castor interacts with Geminin through
its 254 C-terminal amino acids which include its coiled coil. The 254 C-terminal
amino acids are also responsible for the self-association of the molecule. We further
wanted to established which interaction, the heterodimerazition with Geminin or
Castor homodimerazition is stronger. Geminin interacts stronger with Castor, than
Castor with itself since overexpressing Geminin and Castor together results in full
binding of Castor to Geminin
Finally we developed molecular tools required for the functional study of the
molecule. Firstly, a specific polyclonal antibody against the N terimus of Castor was
8
produced and then affinity purified. The specificity of the antibody was tested by
Western blotting analysis. The antibody recognizes the transfected CastorGFP protein,
but no safe conclusion can be drawn for the endogenous protein. Secondly, silencing
Castor by RNAi technique for silencing Castor gene in cell lines was set up. The
effect of the RNAi was tested by Western blotting and immunofluorescence in
CastorGFP stable cell lines. These tools will be required in future studies for
investigating the function of Castor.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/2464 |
| Date | 22 December 2009 |
| Creators | Πεφάνη, Ελευθερία Δάφνη |
| Contributors | Λυγερού, Ζωή, Pefani, Eleutheria Dafni, Ταραβήρας, Σταύρος, Ζαρκάδης, Ιωάννης, Λυγερού, Ζωή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0027 seconds