Η αδειοδότηση εξασφαλίζει τη χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού.
Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η
έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη, διαμέσου πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη της
ισορροπίας της ρύθμισης της αντιγραφής οδηγεί σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο
πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο.
Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό επίσης προκαλείται από βλάβες στο γενετικό
υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών που συμβαίνουν
κατά τη διάρκεια του μεταβολισμού του. Για την αντιμετώπιση των βλαβών έχουν εξελικτικά
προκύψει επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Ο
παράγοντας Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά
της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, γεγονός που τον καθιστά ενδιαφέροντα για περαιτέρω μελέτη.
Στο πρώτο μέρος της μελέτης θα γίνει χαρακτηρισμός μια μεθόδου που προκαλεί ολική ή
εντοπισμένη βλάβη στο γενετικό υλικό κυττάρων με χρήση υπεριώδους ακτινοβολίας. Με τη
τεχνική αυτή θα μελετηθεί σε καρκινικές σειρές η πρωτεΐνη Cdt1 και η ταχύτητα πρωτεόλυσής της.Σε μικροσκόπιο φθορισμού θα μελετηθεί ο εντοπισμός και σε συνεστιακό μικροσκόπιο η κινητική
της πρωτεΐνης αυτής, καθώς και η μεταλλαγμένη μορφή Cdt1 (Cdt1+4A), η οποία δεν αλληλεπιδρά
με το πρωτεολυτικό μηχανισμό Cul4-DDB1Cdt2,. Η μελέτη της κινητικής γίνεται σε ζωντανά
κύτταρα καρκινικών σειρών με σκοπό την κατανόηση της ιεράρχησης των γεγονότων που
συμβαίνουν σε περιοχές στοχευμένης βλάβης από υπεριώδη ακτινοβολία στο γενετικό υλικό. Με
την τεχνική επαναφοράς φθορισμού μετά από φωτολεύκανση (Fluoresent Recovery After
Photobleaching) θα παρακολουθηθεί η επαναφορά του σήματος με σκοπό την ποσοτικοποίηση της
δεσμευμένης πρωτεΐνης.
Στο δεύτερο μέρος της μελέτης θα αναπτυχθούν μέθοδοι κανονικοποίησης και ανάλυσης
6
πειραματικών δεδομένων λειτουργικής μικροσκοπίας με εργαλεία το οποία αναπτύχθηκαν ειδικά
για την ανάλυση πειραμάτων FRAP (easyFRAP). Επίσης αναλύεται η δημιουργία κατάλληλου
λογισμικού και η βελτιστοποίηση τεχνικών παρατήρησης της επαναφοράς του φθορισμού μετά από
μεγάλα χρονικά διαστήματα, της τάξεως των ωρών έναντι της κλασικής μεθόδου όπου η
παρατήρηση διαρκεί κάποια δευτερόλεπτα. Τέλος ακολουθεί σύγκριση της εφαρμογής easyFRAP
με την εφαρμογή FRAPcalc, η οποία χρησιμοποιείται επίσης για την κανονικοποίηση και οπτικοποίηση δεδομένων FRAP. / The process of licensing of DNA replication ensures that the cell cycle proceeds to timely regulated replication. In metazoa, Cdt1 is the factor that ensures the regulation of licensing. Cdt1 is
tightly regulated through various biological pathways and it is functionally conserved through evolution. If the regulation of Cdt1 is disturbed, genomic instability, uncontrolled replication and apoptosis may occur.
Genomic instability may also occur in an organism after DNA damage, either due to
environmental factors, or due to random mutations. Evolution has provided cells with various DNA
damage response mechanisms for all kinds of damages. The cell cycle regulatory protein Cdt1 has
been postulated to link the cell cycle and the DNA damage responses, therefore Cdt1 is a very
interesting protein for further studying.
At the first part of our study we introduced a method for total or localized DNA damage in
live cells with the use of ultraviolet radiation. With this technique we showed that on different
cancer cell lines the protein Cdt1, accumulate fast in the sites of damage. With a fluorescent
microscope we studied the localization and with a confocal microscope we investigated the kinetics
of wild type Cdt1 linked with a green fluorescent protein tag, along with the study of a Cdt1 mutant
(Cdt1+4A) again linked with a green fluorescent protein tag. Cdt1+4A has lost the ability to
associate with the proteolytic mechanism of Cul4-Ddb1Cdt2. In live cells, in order to investigate the
spatiotemporal regulation of DNA damage response we used Fluorescent Recovery after Photobleaching (FRAP) technique and we studied the protein kinetics and we quantified the
percentage of the bound protein on the chromatin.
At the second part of our study, we present the normalization method we used for our raw
experimental data. For the purpose of this analysis, tools and softwares were developed for accurate
normalization. We also aimed to optimize a technique for the observation of fluorescent recovery
after photobleaching during long periods of time, in contrast with the typical short FRAP
experiments. Finally, we describe a brief comparison between the FRAP analysis tool we developed(easyFRAP) and another software commercially available (FRAPcalc) for that purpose.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/6095 |
| Date | 07 June 2013 |
| Creators | Γιακουμάκης, Νικόλαος-Νικηφόρος |
| Contributors | Λυγερού, Ζωή, Giakoumakis, Nikolaos-Nikiforos, Ταραβήρας, Σταυρός, Ζαρκάδης, Ιωάννης, Λυγερού, Ζωή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.008 seconds