Για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας, είναι θεμελιώδους σημασίας η πραγματοποίηση της αντιγραφής του DNA με ακρίβεια και πιστότητα. Στη σωστή χρονικά έναρξη της αντιγραφής σημαντικό ρόλο κατέχει η «αδειοδότηση» της αντιγραφής, η οποία διασφαλίζει ότι η χρωματίνη είναι ικανή για τον επόμενο κύκλο αντιγραφής μόνο αφότου το κύτταρο έχει διέλθει από τη μίτωση. Η αδειοδότηση λαμβάνει χώρα μέσω της διαδοχικής συγκρότησης στις αφετηρίες της αντιγραφής, ενός πολύ-πρωτεϊνικού συμπλόκου, του καλούμενου προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Απαραίτητος για τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου είναι ο παράγοντας Cdt1. Στα μετάζωα, ένα μικρό μόριο, η Geminin, αναστέλλει τη δράση του Cdt1 κατά τις φάσεις S, G2 και Μ. Η Geminin είναι ένα μόριο με δομή σπειροειδούς σπειράματος, το οποίο συμμετέχει σε ευρύ φάσμα μοριακών αλληλεπιδράσεων και ελέγχει διαδικασίες του κυτταρικού κύκλου και της διαφοροποίησης. Η ρύθμιση της Geminin επιτυγχάνεται κύρια σε μεταγραφικό επίπεδο και μέσω πρωτεόλυσης, ενώ πρόσφατα δείχθηκε ότι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του μορίου διασφαλίζουν την απενεργοποίησή του κατά την G1. Για την εκδήλωση της δράσης της Geminin απαιτείται η παρουσία της πρωτεΐνης στον πυρήνα.
Για την ενδοκυτταρική μελέτη της συμπεριφοράς της Geminin, δημιουργήσαμε υβριδικές μορφές του μορίου με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και κατόπιν παροδικής διαμόλυνσης μελετήσαμε τον ενδοκυτταρικό του εντοπισμό. Η εξωγενής Geminin εντοπίζεται στον πυρήνα (όπως και το ενδογενές μόριο) σε έναν υποπληθυσμό ασύγχρονων κυττάρων αλλά επιπλέον, στα μισά κύτταρα του πληθυσμού, αποκλείεται από τον πυρήνα και συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα. Η εμφάνιση της Geminin αποκλειστικά εκτός πυρήνα πραγματοποιείται σε κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και συγκεκριμένα φαίνεται να λαμβάνει χώρα στο τέλος της G1 φάσης, πλησίον της μετάβασης από την G1 στην S. Κατά την είσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση ηρεμίας G0, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν την Geminin στο κυτταρόπλασμα αυξάνεται σημαντικά. Το γεγονός αυτό προσδίδει φυσιολογικό ρόλο στο φαινόμενο του αποκλεισμού της Geminin από τον πυρήνα και το συνδέει με την προαγωγή της αδειοδότησης της αντιγραφής πριν την είσοδο του κυττάρου στην S. Ανάλυση των επιμέρους περιοχών του μορίου με δημιουργία προοδευτικών απαλοιφών περιοχών της Geminin ανέδειξε το ρόλο της αμινοτελικής περιοχής του μορίου (aa 1-30) στον κυτταροπλασματικό εντοπισμό του. Ο πυρηνικός εντοπισμός της Geminin επάγεται από την κεντρική περιοχή του μορίου ενώ ένα αμινοτελικό πιθανολογούμενο NLS δε φαίνεται από μόνο του –τουλάχιστον- στην ανθρώπινη Geminin να αρκεί για τον πυρηνικό εντοπισμό της. Από τους παράγοντες που μελετήθηκαν, οι οποίοι θα μπορούσαν να επηρεάζουν in trans τον εντοπισμό της Geminin, το Cdt1, ο μοριακός συνοδός της Geminin, είναι ικανός να κατευθύνει τον αναστολέα του στον πυρήνα μετά από συνδιαμόλυνση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Συνδιαμόλυνση με μορφές των δύο μορίων που δεν μπορούν να αλληλεπιδράσουν δεν οδηγεί σε πυρηνικό εντοπισμό της Geminin. Συμπεραίνουμε ότι το Cdt1 προκαλεί διαμετατόπιση της Geminin στον πυρήνα μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με αυτήν.
Τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν έναν νέο τρόπο ρύθμισης της Geminin μέσω πυρηνικού αποκλεισμού και παρέχουν πληροφορίες για το πότε και πώς λαμβάνει χώρα αυτή η ρύθμιση.
Πρόσφατα, στις ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων εντοπίσαμε έναν γονιδιακό τόπο που κωδικοποιεί για πρωτεϊνικό μόριο με μεγάλη ομολογία με το σπειροειδές σπείραμα (coiled-coil) της Geminin (Geminin cc-like ή Castor). Στην παρούσα μελέτη εξετάζεται η χωρο-χρονική έκφραση της Geminin cc-like (Castor), οι αλληλεπιδράσεις με υποψήφια μόρια και η συμπεριφορά του μορίου σε συνθήκες υπερέκφρασης και αποσιώπησης σε ανθρώπινα κύτταρα. Για τη μελέτη αυτή δημιουργήθηκε υβριδική μορφή της πρωτεΐνης με την GFP. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι Geminin cc-like (Castor) είναι πυρηνική πρωτεΐνη, όπως και η ενδογενής Geminin και η ενεργότητα σήματος πυρηνικού εντοπισμού φαίνεται να εδράζεται στην καρβοξυτελική περιοχή του μορίου. Η Geminin cc-like (Castor) αλληλεπιδρά με την Geminin και μάλιστα αποτελεί έναν ακόμη παράγοντα, μαζί με το Cdt1, που μπορεί να κατευθύνει in trans την Geminin στον πυρήνα. Πειράματα υπερέκφρασης παρέχουν ενδείξεις για παρεμπόδιση της εισόδου των κυττάρων στη φάση S, ενώ αποσιώπηση της Geminin cc-like (Castor) με τη χρήση RNAi φαίνεται να αυξάνει το ποσό της φωσφορυλιωμένης μορφής της ιστόνης H2Ax, δείκτη διπλών κατατμήσεων στο DNA.
Από εξέταση για την ύπαρξη ορθολόγων σε άλλους οργανισμούς, βρέθηκε ορθόλογη πρωτεΐνη στον ιχθύ Oryzias latipes (medaka). Κλωνοποιήθηκε τμήμα του mRNA της O.l Castor πρωτεΐνης, πραγματοποιήθηκε ανάλυση της έκφρασης της Geminin cc-like (Castor) σε έμβρυα medaka καθώς και πειράματα υπερέκφρασης μετά από ένεση τμήματος του mRNA, τα οποία παρέχουν προκαταρκτικές ενδείξεις για ελαττωματικό σχηματισμό της κεφαλής και των οφθαλμών.
Συμπερασματικά, μελετήσαμε μία νέα πρωτεϊνη στον άνθρωπο η οποία εμφανίζει μερική ομολογία προς την Geminin (Geminin cc-like ή Castor), και δείξαμε ότι αποτελεί ένα νέο μοριακό συνοδό της Geminin, με πιθανή συμμετοχή σε κυτταρικό κύκλο και διαφοροποίηση. / For genomic stability to be maintained, accurate regulation of replication has to be achieved. Replication licensing takes places during G1 and involves the stepwise formation of a multimeric complex, the pre-replicative complex (pre-RC), onto origins of replication, ensuring that chromatin will be competent for replication only once per cell cycle. Cdt1, a key component of this complex, is accurately regulated throughout cell cycle, through multiple mechanisms. Geminin, a metazoan-specific inhibitor of licensing, binds and inhibits Cdt1, thus preventing ectopic pre-RC formation during S, G2 and M. Geminin is regulated both at the level of transcription and proteolysis. Recently, it was also demonstrated that inactivation of non-proteolysed Geminin during G1 ensures timely formation of the pre-RC. Through its coiled-coil region, many interactions with binding partners are achieved, thus enabling participation in a variety of cellular processes during the cell cycle and differentiation.
In order to study the intracellular behaviour of Geminin, fused forms of the molecule with the fluorescent protein GFP were constructed and transfected in MCF7 cells. Exogenous Geminin is located in the nucleus, similar to the endogenous molecule, in a subpopulation of asynchronously growing cells, but in approximately 50% of cells, Geminin is specifically excluded from the nucleus. Cytoplasmic localization of Geminin takes place during G1 and specifically during late G1, close to the G1 to S transition. In addition, upon exit from quiescence and cell cycle re-entry, cytoplasmic localization of Geminin increases notably. This may reflect a physiological role of Geminin exclusion to the cytoplasm upon cell cycle re-entry, in order to permit a ‘window of opportunity’ for licensing to take place prior to S phase onset. Progressive deletions of the Geminin molecule resulted in a variety of mutated forms which were then analysed for their ability to be localized to the nucleus or the cytoplasm. This analysis showed the importance of the aminoteminal region of Geminin (aa 1-30) in the cytoplasmic localization of the molecule. A putative nuclear localization activity was mapped to the central part of the molecule, while a proposed NLS at the aminoterminal part was shown to be neither sufficient nor required for nuclear localization. Amongst the factors tested, which could affect intracellular localization of Geminin, we show that Cdt1 possesses the ability to direct Geminin to the nucleus. Our data provide evidence for a novel means of regulation of Geminin by cell cycle dependant subcellular localization and offer insight on when and how this regulation takes place.
Recently, in silico analysis revealed a gene locus in the human genome, coding for a predicted coiled coil protein with homology to Geminin. The gene product was initially named after this similarity as Geminin coiled coil-like (Geminin cc-like) and then renamed ‘Castor’. Present work examines the spatio-temporal expression of a hybrid Castor-GFP molecule, interactions with candidate molecular partners and the consequences for the cell of Castor overexpression or silencing. Our results show that exogenous Castor-GFP is localized in the nucleus and excluded from the nucleoli, similar to endogenous Geminin, whereas evidence for a putative NLS activity at the carboxy-terminus of the molecule is provided. Castor interacts with Geminin in cellular extracts and is sufficient to translocate Geminin-GFP to the nucleus, similar to Cdt1. Overexpression experiments provided evidence for a delayed G1 to S transition. Silensing Castor by siRNA led to an increase in γ-H2Ax staining, a marker of double strand breaks. Further in silico analysis revealed orthologues of Castor in other organisms, from mammals to fish. Part of the putative Castor mRNA in the fish Oryzias latipes (Medaka) was cloned. In vivo analysis of Castor in medaka involved expression pattern analysis by whole mount in situ hybridization and overexpression amalysis by mRNA injections, providing preliminary evidence for impaired forehead and eye formation. In conclusion, we have studied a novel protein with similarity to the coiled-coil region of Geminin (Geminin cc-like/ Castor) and showed that it constitutes a novel molecular partner of Geminin with possible roles during the cell cycle and in development.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/3822 |
| Date | 20 October 2010 |
| Creators | Δημάκη, Μαρία |
| Contributors | Λυγερού, Ζωή, Dimaki, Maria, Μοσχονάς, Νικόλαος, Ταραβήρας, Σταύρος, Αθανασιάδου, Αγλαϊα, Μουζάκη, Αθανασία, Συνετός, Διονύσιος, Χαμπαίος, Ιωάννης, Λυγερού, Ζωή |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0038 seconds