Η γεωμορφολογία της Ελλάδας και η ποικιλία των βιοτόπων της την καθιστούν ιδιαίτερη περιοχή μελέτης ως προς την ερπετοπανίδα της. Σήμερα, εκτιμάται ότι στην Ελλάδα υπάρχουν 64 είδη ερπετών, με τα εννέα από αυτά να είναι ενδημικά. Το κεφαλονίτικο κονάκι Anguis cephallonica πρόκειται για μια περίπτωση άποδης σαύρας με κρυπτική οικολογία, που εντοπίζεται στην Πελοπόννησο και τα νησιά Κεφαλονιά, Ζάκυνθος και Ιθάκη του Ιονίου Πελάγους.
Έως πρόσφατα, αναγνωρίζονταν δύο είδη στο γένος Anguis (Reptilla: Anguidae): το A. cephallonica Werner, 1894 και το A. fragilis Linnaeus, 1758 με το δεύτερο να θεωρείται ότι εξαπλώνεται σε ολόκληρη τη δυτική περιοχή της Παλαιαρκτικής. Σήμερα, οι εξελικτικές γραμμές του γένους έχουν μερικώς αποκαλυφθεί. Εκτός από τα δύο προαναφερόμενα, θεωρούνται αποδεκτά τα είδη A. colchica (Nordmann 1840) και A. graeca Bedriaga, 1881, ενώ πρόσφατα προτάθηκε και η ύπαρξη ενός νέου είδους, του A. veronensis Pollini, 1818. Από αυτά, εκτός του A. cephallonica, εντοπίζονται στην Ελλάδα το ευρωπαϊκό κονάκι A. fragilis, που απαντάται στη Βόρεια Ελλάδα και το ελληνικό κονάκι A. graeca, που απαντάται στην ηπειρωτική Ελλάδα δυτικά της κεντρικής Μακεδονίας, στην Εύβοια, στη Βόρεια Πελοπόννησο και στα νησιά Κέρκυρα και Λευκάδα.
Στην παρούσα εργασία, σκοπός είναι η διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεων και η ταξινόμηση των γενεαλογικών γραμμών τόσο εντός του είδους A. cephallonica, όσο και σε σχέση με τα συγγενικά με αυτό είδη- ιδιαίτερα με το μερικώς συμπάτριο A. graeca, έτσι ώστε να προσεγγισθούν βασικά ερωτήματα που αφορούν στις διεργασίες που καθόρισαν ή επηρέασαν την εξελικτική και βιογεωγραφική ιστορία του είδους. Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένα εκτεταμένο δίκτυο πληθυσμών από τοποθεσίες της Πελοποννήσου, της Κεφαλονιάς και της δυτικής ηπειρωτικής Ελλάδας.
Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε αρχίζει με την εξαγωγή ολικού γονιδιωματικού DNA από κάθε χρησιμοποιούμενο δείγμα και συνεχίζεται με την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης για τον μοριακό δείκτη που χρησιμοποιήθηκε, τον καθαρισμό του προϊόντος της PCR και την αλληλούχηση. Ο μοριακός δείκτης που επιλέχθηκε για την προσέγγιση των φυλογενετικών σχέσεων και τη διερεύνηση των γενεαλογικών γραμμών τόσο εντός του A. cephallonica, όσο και μεταξύ αυτού και των συγγενών με αυτό ειδών, είναι το τμήμα του μιτοχονδριακού DNA που περιέχει το κωδικό γονίδιο ND2 και πέντε αλληλουχίες tRNA και επιλέχθηκε κυρίως γιατί έχει χρησιμοποιηθεί ευρύτατα και με επιτυχία σε άλλες φυλογενετικές αναλύσεις ερπετών και αμφιβίων, ενώ φέρει όλα τα πλεονεκτήματα του μιτοχονδριακού DNA.
Μετά το πέρας της πειραματικής διαδικασίας είχαν προσδιορισθεί 22 νέες αλληλουχίες για τον μοριακό δείκτη, που αντιστοιχούν σε 14 απλοτύπους. Πιο συγκεκριμένα, για το A. cephallonica προσδιορίσθηκαν 17 αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε εννέα απλοτύπους και για το είδος A. graeca προσδιορίσθηκαν πέντε αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε πέντε διαφορετικούς απλοτύπους. Στην ανάλυση συμπεριελήφθησαν ακόμα 19 αλληλουχίες, που ανακτήθηκαν από τη βάση δεδομένων του Εθνικού Κέντρου Βιοτεχνολογικής Πληροφορίας των ΗΠΑ NCBI (National Center for Biotechnology Information), έτσι ώστε συνολικά, για το είδος A. cephallonica στην ανάλυση να έχουν συμπεριληφθεί 19 αλληλουχίες που ισοδυναμούν με εννέα απλοτύπους, για το είδος A. graeca 19 αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε 16 διαφορετικούς απλοτύπους και για το είδος A. fragilis δύο αλληλουχίες που αντιστοιχούν σε δύο διαφορετικούς απλοτύπους.
Μετά την ανάγνωση των αλληλουχιών σειρά είχε η εκτίμηση των γενετικών αποστάσεων με βάση τo μοντέλο Tamura–Nei και η φυλογενετική ανάλυση. Εφαρμόσθηκαν τρεις διαφορετικές μέθοδοι αναλύσεων: η μέθοδος Σύνδεσης Γειτόνων, Μέγιστης Πιθανοφάνειας και Μπεϋεσιανής Συμπερασματολογίας. Ως εξωομάδα, χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις αναλύσεις ένας απλότυπος Pseudopus apodus. Η χρήση του κρίθηκε κατάλληλη εφόσον τα γένη Pseudopus και Anguis είναι αδελφά taxa, με το είδος Pseudopus apodus να εντοπίζεται στην Ελλάδα. Με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, όσον αφορά τόσο στις γενετικές αποστάσεις όσο και στις φυλογενετικές αναλύσεις, τα διαθέσιμα δεδομένα για τον μοριακό δείκτη που επιλέχθηκε κατατάχθηκαν ευκρινώς σε τρία διαφορετικά taxa που αντιστοιχούν στα είδη A. cephallonica, A. graeca και A. fragilis.
Στην τοπολογία των φυλογενετικών δέντρων διακρίνονται τρεις κλάδοι, με απόλυτη στατιστική υποστήριξη, που αντιστοιχούν σε κάθε ένα από τα τρία προαναφερόμενα είδη Anguis. Η τοπολογία των δέντρων δείχνει ότι το ελληνικό κονάκι A. graeca φαίνεται να ακολουθεί ένα γενικό γεωγραφικό πρότυπο με κατεύθυνση από τον βορρά προς τον νότο. Στην ανάλυση με τη μέθοδο της μέγιστης πιθανοφάνειας, το ελληνικό κονάκι A. graeca ομαδοποιείται εγγύτερα στο κεφαλλονίτικο κονάκι A. cephallonica, από ό, τι στο A. fragilis, ωστόσο με πολύ χαμηλή στατιστική υποστήριξη. Από άποψη γενετικής απόστασης, βρίσκεται εγγύτερα στο είδος A. fragilis, κάτι που συμφωνεί και με το γεωγραφικό πρότυπο εξέλιξης του κάθε είδους. Τα φυλογενετικά δέντρα συμφωνούν για το είδος A. cephallonica, όσον αφορά στη σχέση των κύριων κλάδων με τα γεωγραφικά δεδομένα. Το κεφαλλονίτικο κονάκι A. cephallonica φαίνεται να ακολουθεί ένα σαφές γενικό γεωγραφικό πρότυπο εξέλιξης στην Πελοπόννησο και το Ιόνιο, από τα νότια προς τα βόρεια ή τα βορειοδυτικά. Η ανάλυση με τις μεθόδους μπεϋεσιανής συμπερασματολογίας, μέγιστης πιθανοφάνειας και σύνδεσης γειτόνων συμφωνούν μεταξύ τους και αποκαλύπτουν διακριτές και γεωγραφικά εντοπισμένες επιμέρους γενεαλογικές γραμμές.
Πλέον, μπορούμε να υποστηρίξουμε ότι το είδος A. fragilis, που θεωρείτο ότι καλύπτει την μεγαλύτερη περιοχή της ηπειρωτικής Ελλάδας, έχει το νότιο όριό του στην Βόρεια Ελλάδα. Επίσης, το είδος A. colchica δεν θεωρείται πλέον ότι εξαπλώνεται ως τα νότια Βαλκάνια. Η μορφή που συναντούμε νοτιότερα στην ηπειρωτική Ελλάδα, μέχρι και την Πελοπόννησο, χωρίς ωστόσο το όριο της εξάπλωσής της στην Πελοπόννησο να μπορεί να ορισθεί με βεβαιότητα, γνωρίζουμε, πλέον, ότι είναι διαφορετικό είδος, το ελληνικό κονάκι A. graeca. Τα διαφορετικά εξελικτικά πρότυπα, οι γενετικές αποστάσεις και τοπολογίες των ειδών A. graeca και A. cephallonica αποκλείουν μία κοινή γενεαλογική γραμμή στον ελλαδικό χώρο, που μπορεί να οδήγησε στην σημερινή εξάπλωση του γένους σε αυτόν. Σε συνδυασμό με το στοιχείο της μικρότερης γενετικής απόστασης που συνδέει το A. graeca με το A. fragilis, φαίνεται να επαληθεύεται η υπόθεση πως το κεφαλλονίτικο κονάκι ανήκει σε διαφορετικό εξελικτικό κλάδο από αυτόν που ανήκουν τα δύο άλλα είδη. Οι δύο εξελικτικές γραμμές φαίνεται ότι συναντήθηκαν γεωγραφικά, με αποτέλεσμα τη μερικώς συμπάτρια εξάπλωσή τους στη Βόρεια Πελοπόννησο.
Η παρούσα εργασία επιχειρεί να διαλευκάνει τμήμα της εξελικτικής διαφοροποίησης εντός του γένους Anguis. Μπορεί να συμβάλει σε μελλοντικές προσπάθειες περαιτέρω διερεύνησής της, όπως και σε μελέτες που θα ασχοληθούν με τη διαχείριση των πληθυσμών του. / The geomorphology and the vast diversity of biotopes make Greece a special region as far as the reptile fauna is concerned. It is estimated that Greece is the home of 64 reptile species with nine of them being characterized as endemic. One of them is the slowworm of Cephalonia, Anguis cephallonica, which is a legless lizard of cryptic ecology, found in Peloponnesus and the islands of Cephalonia, Zakynthos and Ithaca of the Ionian Sea.
Up until recently, only two species were recognized among the Anguis genus (Reptilla: Anguidae): A. cephallonica Werner, 1894 and A. fragilis Linnaeus, 1758. A. fragilis dispersal was supposed to cover a wide region of the whole western Palaiarctic. Today, it is believed that the evolutionary lineages of the genus complex has been partially revealed. Apart from the aforementioned species, A. colchica (Nordmann, 1840), A. graeca Bedriaga, 1818 and the recently proposed from the Italian peninsula A. veronensis Pollini, 1818 have also been referred as different species, with A. cephallonica, A. graeca and A. fragilis occurring in the Greek region. The European slowworm A. fragilis is supposed to be found in Northern and North-Eastern Greece, while the dispersal of the Greek slowworm, A. graeca corresponds to western continental Greece, towards Euboia and Northern Peloponnesus and also to the Ionian islands of Corfu and Lefkas.
The aim of the present study focuses on the revealing of the phylogenetic relationships and the classification of the genealogical lineages both within A. cephallonica and also between A. cephallonica and the partially sympatric A. graeca, so that the basic questions, which relate to the processes which affected and determined the evolutionary and biogeographic history of the species, are approached. For this purpose, an extensive population net was used from locations from Peloponnesus, Cephalonia and western continental Greece.
The experimental procedure followed begins with the whole genomic DNA extraction for each sample included in this study. The procedure continues with PCR amplification for the mitochondrial molecular marker selected, clean-up of the PCR product and sequencing. The molecular marker selected is a fragment of mitochondrial DNA, which includes ND2 gene and five smaller sequences which are transcripted to tRNAs. This particular marker was selected, mostly because of the successful application of which in former phylogenetic studies of reptiles and amphibians, while it also carries all the advantages that refer to mitochondrial DNA.
After the laboratorian procedure was completed, 22 new sequences had been determined, corresponding to 14 different haplotypes. 17 sequences corresponding to nine haplotypes referring to A. cephallonica and five sequences each corresponding to a different haplotype referring to A. graeca. 19 more sequences retrieved from NCBI were included in the phylogenetic analysis, so as for A. cephallonica to sum up to nine haplotypes and for A. graeca to 16. Also, two sequences corresponding to two haplotypes were included for A. fragilis.
After the sequences data set editing, the estimation of the genetic distences among them, using the Tamura Nei model, and also the phylogenetic analysis could proceed. Three different methods were used for the cladograms to be built: Neighbour Joining, Maximum likelihood and Bayesian Inference. A Pseudopus apodus haplotype was used as an outgroup for the genetic distances estimation and the phylogenetic analyses, as this species is found in Greece with the Pseudopus genus being quite relative to genus Anguis. The haplotype trees built, both based on genetic distances estimation and also on phylogenetic analysis, all agreed on a three clade motif, each corresponding to one of the three Anguis species included.
The phylogenetic trees topology discriminates three clades each corresponding to one of the three Anguis species, with absolute statistical support. All trees topology shows that A. graeca follows a genetical degradation among a North to South axon. In ML analysis, A. graeca is more closely grouped with A. cephallonica rather than A. fragilis; however, the statistical support is extremely low while this doesn’t agree both with the genetic distance estimations and also with the geographical pattern of each species.
Phylogenetic trees agree as far as the internal A. cephallonica clades are concerned, in accordance with geographical correspondence. A. cephallonica seems to follow a clear general geographical evolutionary pattern from the South to the North or Northwest. BI and ML analyses agree, showing discrete and geographically located genealogical lines.
We can now support that A. fragilis, which was supposed to cover all continental Greece region has its south European border at Northern Greece. Also, A. colchica dispersal does not reach Southern Balkans, as it was formerly believed. The morphotype which corresponds to findings from continental Greece and north Peloponnesus is identified as A. graeca, the Greek slow worm. Different evolutionary patterns, genetic distances and tree topologies outrule a common genealogical line within the Greek region for the two species. it seems that the hypothesis of closer connection for the Greek and the European slowworm is confirmed, with the slowworm from Cephalonia belonging to a different evolutionary clade.
Present study is intended on revealing a part of the evolutionary differentiation within Anguis genus in Greece. it can thus contribute to future attempts of further investigation and also should be taken under consideration for future conservation and protection management decisions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/7643 |
| Date | 27 May 2014 |
| Creators | Βούλγαρη-Κόκοτα, Άννα |
| Contributors | Γκιώκας, Σίνος, Voulgari-Kokota, Anna, Γκιώκας, Σίνος, Κλώσσα-Κίλια, Ελένη, Χονδρόπουλος, Βασίλειος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 0 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.004 seconds