Zu den Eigenschaften eukaryotischer Zellen gehört ihre Kompartimentierung, welche
durch die Abtrennung verschiedener Reaktionsräume durch Lipiddoppelschichten
erreicht wird. Verschiedene Vesikel-Transportwege verbinden diese Kompartimente
miteinander, einer dieser Wege in der Hefe Saccharomyces cerevisiae ist der
sogenannte ALP-Weg. Dieser gehört zu den biosynthetischen Wegen, über die neue
Proteine an ihren Bestimmungsort gebracht werden, in diesem Falle die Vakuole.
Ausgehend vom Golgi-Apparat werden die Vesikel dieses Weges mit Hilfe des
Adaptorproteinkomplexes-3 (AP-3) gebildet. Ein weiteres Protein, das eine spezifische
Funktion in diesem Weg übernimmt, ist Vps41. Ein aktuelles Modell beschreibt seine
Funktion in der Aufnahme der Vesikel an der Vakuole. Es konnte gezeigt werden, das
Vps41 mit der sogenannten ear-Domäne von Apl5, einer Untereinheit des AP-3-
Komplexes, interagiert.
In dieser Arbeit konnte ich nachweisen, dass die Interaktionsstelle im Vps41 innerhalb
einer konservierten PEST-Domäne liegt. Eine Deletion dieser Domäne beeinflußte die
Funktion des Proteins im ALP-Weg jedoch nicht die in der homotypischen
Vakuolenfusion und im CPY-Weg. Eine weitere Eingrenzung des deletierten
Bereiches zeigte, dass die PEST-Domäne eine Sequenz enthält, die einem Di-Leucin-
Sortierungssignal ähnlich ist. Dieses konnte ich als minimal notwendigen Bereich für
die Wechselwirkung mit der Apl5-ear-Domäne bestimmen. Meine Daten zeigen, dass
dieser Bereich des Proteins notwendig ist für das Docking der AP-3-Vesikel an der
Vakuole. Weiterhin konnte ich eine kompetitive Bindung von Liposomen und Apl5 an
die N-terminale Hälfte von Vps41 zeigen. Zusammengefasst und mit aktuellen
Veröffentlichungen in Zusammhang gebracht, ergänzen meine Daten das Modell der
Funktion von Vps41 in der Vesikelaufnahme an der Vakuole:
Vps41 wird durch die Rab-GTPase Ypt7, als deren Effektorprotein, an späte
Endosomen gebunden. An dieser stark gekrümmten Membran taucht ein kürzlich
identifiziertes ALPS (amphipathic lipid packing sensor)-Motiv im Vps41 in die
Membran des Organells ein und zieht so den N-terminalen Bereich mit der Bindestelle
für die AP-3-Vesikel an die Oberfläche des Organells wodurch eine verfrühte Fusion
der AP-3-Vesikel mit dem Endosom verhindert wird. Erst nach der Reifung zur
Vakuole wird die PEST-Domäne für die Bindung an Apl5 verfügbar, da sich die
Membrankrümmung ändert. Zusätzlich wird das ALPS-Motiv phosphoryliert, so dass
dieses nicht mehr in die Membran eintauchen kann. Erst jetzt ist eine Interaktion
zwischen Apl5 und Vps41 und damit eine Fusion der AP-3-Vesikel mit der Vakuole
möglich.
Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Protonentranslokation durch den
Fo-Teil der ATP-Synthase aus Escherichia coli. Durch Mutagenese wurden ATP-Synthasen
hergestellt, in denen die beiden für den Protonentransport essentiellen
Aminosäurereste D61 in der Untereinheit c und R210 in der Untereinheit a in der
α-Helix in der sie liegen, entweder einzeln oder beide zusammen, um je eine
Helixwindung nach oben oder unten verschoben wurden. Dies führt zu einer
Verlängerung bzw. Verkürzung der Protonenzu- und austrittskanäle. Durch die
Untersuchung der Funktionalität dieser ATPasen auf sowohl aktives und passives
Protonenpumpen, als auch ATP-Synthese konnte ich zeigen, daß die Position der
beiden essentiellen Aminosäurereste cD61 und aR210 zueinander nicht entscheidend ist.
Werden beide Reste in die gleiche Richtung verschoben, so daß ihre Position
zueinander gleich bleibt, kommt es unabhängig von der Richtung immer zu einem
kompletten Funktionsverlust. Weiterhin läßt sich aus meinen Daten folgern, daß die
Position des Restes aR210 in der Mitte der Membran wichtig ist. Beim Verschieben des
Restes auf die Position 206 (a-up) geht die gesamte Funktion des Fo-Teiles verloren,
während das Verschieben auf die Position 214 (a-down) zu einem passiven Ausströmen
der Protonen durch den Fo-Teil führt.
Die Position des Restes cD61 in der Membran ist flexibler. Obwohl die
Repositionierung des Aspartats auf die Position 57 (c-up) jegliche Funktionalität des Fo-Teiles beeinträchtigt, ermöglicht ein Verschieben auf die Position 65 (c-down)
aktives und passives Protonenpumpen, sowie die Synthese von ATP.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-osnabrueck.de/oai:repositorium.ub.uni-osnabrueck.de:urn:nbn:de:gbv:700-201007096404 |
| Date | 09 July 2010 |
| Creators | Langemeyer, Lars |
| Contributors | apl. Prof. Dr. Siegfried Engelbrecht-Vandré, Prof. Christian Ungermann |
| Source Sets | Universität Osnabrück |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/zip, application/pdf |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/ |
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