Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo esporulado contaminante habitual de alimentos tanto frescos como procesados. La detección y cuantificación de este patógeno de alimentos se realiza habi-tualmente por técnicas culturales. Dichas técnicas consumen mucho tiempo y, en ocasiones, llevan a identificaciones erróneas. Como alternativa, las técnicas moleculares basadas en la PCR tienen como ventaja una mayor rapidez y seguridad en la identificación del microorganismo, e incluso permiten su cuantificación mediante PCR a tiempo real (Q-PCR). En este estudio se han desarrollado diferentes métodos para el control de este microorganismo en alimentos, basados en la técnica de la PCR.A partir de una colección de cepas de referencia y aislados de alimentos, identificados previamente por métodos fenotípicos, (ISO 7932 y API-50CH/B) y genotípicos, (ISR-PCR y RAPD), se determinó la presencia de genes relacionados con factores de virulencia mediante PCR convencional. El gen pc-plc se detectó en un mayor porcentaje en las cepas del "grupo B. cereus", y dado que se encuentra en una única copia por genoma, fue seleccionado como gen diana. Se diseñaron 4 oligonucleótidos para el desarrollo de procedimientos de Q-PCR en modo SYBR Green y Taqman. Se optimizaron los parámetros de la reacción de cuantificación, y se evaluó su especificidad para el "grupo B. cereus", resultando más adecuado el procedimiento de SYBR Green Q-PCR. A continuación se ensayó la capacidad para la detección y cuantificación en alimentos contaminados artificialmente: huevo líquido y leche en polvo infantil. Como resultado el sistema desarrollado ha demostrado su capacidad para la cuantificación de B. cereus entre 105 y 100 ufc/ml a partir de la matriz ensayada, que corresponde al mismo nivel que el método de referencia por recuento en placa. Dado que B. cereus puede estar presente en alimentos tanto en forma vegetativa como esporulada, para su detección por PCR se abordó, asimismo el desarrollo de un protocolo para asegurar la liberación del DNA a partir de esporas. Se partió de suspensiones calibradas de esporas que fueron sometidas a diferentes tratamientos: a) térmicos y b) adición de germinadores en diferentes combinaciones. Tras los tratamientos, se realizó la extracción de DNA con DNeasy Tissue kit (Qiagen), se cuantificó y se evaluó el rendimiento espectrofluorimétricamente (PicoGreen, Invitrogen) y mediante PCR convencional y SYBR Green Q-PCR. El tratamiento de germinación con 0,5 mM L-alanina/inosina resultó el más eficiente en suspensiones concentradas de esporas. Sin embargo, cuando se ensayó en alimentos inoculados (104 - 100 esporas/ml), la extracción con DNeasy Tissue Kit, sin necesidad de tratamientos previos, resultó satisfactorio.Por último, se realizó una aproximación cuantitativa para la detección de formas viables de B. cereus. Para ello se desarrolló un procedimiento de PCR a tiempo real con transcripción inversa (Q-RT-PCR) utilizando como diana el RNA mensajero del gen pc-plc, como indicador del estado de viabilidad celular. El nivel de sensibilidad obtenido por Q-RT-PCR fue de 30 células/reacción a partir de suspensiones celulares, y de 847 células/reacción tras su aplicación en huevo líquido.Los procedimientos de Q-PCR y Q-RT-PCR desarrollados en este estudio han mostrado ser eficientes para detectar la presencia de las especies del "grupo B. cereus" en alimentos, al menos al mismo nivel que el método de referencia, permitiendo además la cuantificación incluso de formas viables. / Bacillus cereus is a rod-shaped, Gram-positive sporeforming bacterium widely recognized as a food poisoning organism. Detection of this pathogen in food is usually carried out by culture techniques that are time consuming and frequently lead to misidentifications. As an alternative, molecular genetic techniques allow rapid, sensitive and accurate detection. In the present work, PCR based systems were applied for a rapid and unequivocal detection of "B. cereus group" which would be very valuable in food safety assessment. The presence of virulence genes was tested by PCR amplification in a collection of reference strains and food isolates that had been phenotypically and genotypically characterized. The pc-plc gene showed the highest prevalence among the tested strains and five oligonucleotides were designed in order to develop SYBR Green and TaqMan real-time PCR (Q-PCR) procedures. The SYBR Green Q-PCR was applied on spiked liquid egg and dried infant formulae showing suitable quantification results in a range of 105 to 100 ufc/ml, and high degrees of correspondence between Q-PCR assays and plate counts. To assess detection of B. cereus spores by PCR procedures, several DNA isolation methods were tested on spore suspensions: i) heat treatment and ii) germination triggered by nutrient germinants followed by DNA isolation (DNeasy tissue kit, Qiagen). Recovery of DNA was evaluated by PCR, Q-PCR, and PicoGreen fluorescence (Invitrogen). Germination with L-alanine 0.5 mM/inosine 0.5 mM rendered the maximum rate of DNA at 108 spores/ml. However, DNA extraction without any modifications rendered similar DNA recovery on 105 to 100 spores/ml range. Spore detection was established in 3-4 spores/reaction using both spore suspensions and spiked food samples. Besides pathogen detection, cell viability is important in food safety. Thus a one-step Q-RT-PCR detection system, was established to investigate the presence of metabolically active cells. By using this approach, 30 cells/reaction and 847 cells/reaction were detected in cell suspensions and spiked liquid egg samples, respectively.The developed Q-PCR and Q-RT-PCR systems proved to be highly sensitive and specific for the rapid and accurate detection and quantification of species of the "B. cereus group" in food, and constitute a promising tool in the detection of B. cereus including spores as well as viable cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/10082 |
| Date | 12 September 2008 |
| Creators | Martínez Blanch, Juan Fco. |
| Contributors | Garay Aubán, Esperanza, Aznar Novella, Rosa, Universitat de València. Departament de Medicina Preventiva, Salut Pública, Bromatologia, Toxicologia i Medicina Legal |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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