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Previous issue date: 2015-02-27 / O crescente interesse e aplica??es dos produtos biotecnol?gicos v?m aumentando o
desenvolvimento de novos processos de recupera??o e purifica??o de prote?nas. A
adsor??o em leito expandido (ALE) tem se destacado como uma t?cnica promissora
para essa finalidade, pois combina em uma ?nica opera??o as etapas de
clarifica??o, concentra??o e purifica??o da prote?na alvo, reduzindo assim tempo e
custos de opera??o. Neste contexto, o objetivo desta tese foi avaliar a recupera??o e
purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli M15 e a
remo??o de endotoxina por ALE. Na primeira etapa do trabalho foram realizados
ensaios em taques agitados sob a forma de dois planejamentos experimentais, para
definir as condi??es ?timas de adsor??o e elui??o do ant?geno na resina Streamline
chelating. Nos ensaios de adsor??o usando o leito na forma expandida empregou-se
uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30,0 cm de altura, acoplada a uma bomba
perist?ltica. Na segunda etapa do trabalho, avaliou-se a remo??o de endotoxina
durante o processo de recupera??o do ant?geno, empregando o tensoativo n?oi?nico
triton X-114 na etapa de lavagem da ALE. Na terceira etapa, buscou-se
elaborar um modelo matem?tico capaz de prever as curvas de ruptura do ant?geno
503 em coluna na forma expandida. Os resultados do planejamento experimental
para adsor??o do ant?geno 503 mostraram o pH 8,0 e a concentra??o de NaCl de
2,4 M como melhores condi??es de adsor??o. No segundo planejamento, o ?nico
fator significativo para elui??o foi a concentra??o de imidazol, definida em 600 mM. A
isoterma de adsor??o do ant?geno 503 mostrou bom ajuste ao modelo de Langmuir
(R=0,98) e os valores de qmax (capacidade m?xima de adsor??o) e Kd (constante de
equil?brio) estimados foram de 1,95 mg/g e 0,34 mg/mL, respectivamente. Atrav?s
dos testes de purifica??o diretamente do homogeneizado n?o clarificado obteve-se
uma recupera??o de 59,2% da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de
6,0. A adi??o do tensoativo n?o-i?nico Triton X-114 ? etapa de lavagem da ALE
proporcionou altos valores (>99%) de remo??o do LPS inicialmente presente nas
amostras para todas as condi??es estudadas. O modelo matem?tico obtido para
descrever a curva de ruptura do ant?geno 503 na resina Streamline Chelanting em
leito expandido apresentou bom ajuste aos dados experimentais, tanto para etapa
de estimativa de par?metros quanto para de valida??o. O modelo validado foi
utilizado na otimiza??o das efici?ncias, obtendo-se os valores m?ximos de efici?ncia
do processo e efici?ncia da coluna de 89,2% e 75,9%, respectivamente. Portanto,
ALE mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o da prote?na-alvo e
remo??o de endotoxina a partir de um extrato de E. coli n?o clarificado em apenas
uma etapa. / The growing interest and applications of biotechnology products have increased the
development of new processes for recovery and purification of proteins. The
expanded bed adsorption (EBA) has emerged as a promising technique for this
purpose. It combines into one operation the steps of clarification, concentration and
purification of the target molecule. Hence, the method reduces the time and the cost
of operation. In this context, this thesis aim was to evaluate the recovery and
purification of 503 antigen of Leishmania i. chagasi expressed in E. coli M15 and
endotoxin removal by EBA. In the first step of this study, batch experiments were
carried out using two experimental designs to define the optimal adsorption and
elution conditions of 503 antigen onto Streamline chelating resin. For adsorption
assays, using expanded bed, it was used a column of 2.6 cm in diameter by 30.0 cm
in height coupled to a peristaltic pump. In the second step of study, the removal of
endotoxin during antigen recovery process was evaluated employing the non-ionic
surfactant Triton X-114 in the washing step ALE. In the third step, we sought
developing a mathematical model able to predict the 503 antigen breakthrough
curves in expanded mode. The experimental design results to adsorption showed the
pH 8.0 and the NaCl concentration of 2.4 M as the optimum adsorption condition. In
the second design, the only significant factor for elution was the concentration of
imidazole, which was taken at 600 mM. The adsorption isotherm of the 503 antigen
showed a good fit to the Langmuir model (R = 0.98) and values for qmax (maximum
adsorption capacity) and Kd (equilibrium constant) estimated were 1.95 mg/g and
0.34 mg/mL, respectively. Purification tests directly from unclarified feedstock
showed a recovery of 59.2% of the target protein and a purification factor of 6.0. The
addition of the non-ionic surfactant Triton X-114 to the washing step of EBA led to
high levels (> 99%) of LPS removal initially present in the samples for all conditions
tested. The mathematical model obtained to describe the 503 antigen breakthrough
curves in Streamline Chelanting resin in expanded mode showed a good fit for both
parameter estimation and validation steps. The validated model was used to optimize
the efficiencies, achieving maximum values of the process and of the column
efficiencies of 89.2% and 75.9%, respectively. Therefore, EBA is an efficient
alternative for the recovery of the target protein and removal of endotoxin from an E.
coli unclarified feedstock in just one step.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufrn.br:123456789/20108 |
| Date | 27 February 2015 |
| Creators | Sousa J?nior, Francisco Canind? de |
| Contributors | 87510383404, http://lattes.cnpq.br/4330639792072559, Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira, 76111830449, http://lattes.cnpq.br/4651814546820796, Cavalcanti, Jorge dos Santos, 40713636491, http://lattes.cnpq.br/2399507418758066, Porto, Ana L?cia Figueiredo, 25514776468, http://lattes.cnpq.br/4989617783837981, Silva J?nior, Ivanildo Jos? da, 97038962434, http://lattes.cnpq.br/8628710115274949, Santos, Everaldo Silvino dos |
| Publisher | Universidade Federal do Rio Grande do Norte, PROGRAMA DE P?S-GRADUA??O EM BIOTECNOLOGIA, UFRN, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFRN, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Norte, instacron:UFRN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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