[ES] Las modificaciones químicas post-transcripcionales implican un nuevo nivel de modulación de la expresión génica. Al comienzo de esta Tesis, algunos componentes del complejo de metilación del nitrógeno en posición 6 de la adenosina (m6A) habían sido caracterizados en plantas. Sin embargo, a diferencia de mamíferos y levadura, ninguno de los 13 homólogos de AlkB (atALKBH1-10B) - potenciales desmetilasas (o erasers) - y las 13 proteínas de la familia YTH (ECT1- 11, AT4G11970 y CPSF30) - potenciales proteínas de reconocimiento de m6A (o readers) - identificadas en el genoma de Arabidopsis se habían caracterizado funcionalmente. Además, varios estudios describen la presencia de m6A en RNAs de virus de mamíferos y las diferentes funciones que desempeña esta modificación en la regulación de esas infecciones. No obstante, no se ha estudiado la posible implicación de este mecanismo molecular en las infecciones virales de plantas. El descubrimiento de la interacción entre la CP del virus del mosaico de la alfalfa (AMV) y una proteína de Arabidopsis (atALKBH9B) con homología a una eraser humana fue el punto de partida de esta Tesis. En este trabajo se confirma esta interacción, y se demuestra que atALKBH9B también puede reconocer los RNAs virales. Los resultados revelan que atALKBH9B tiene la capacidad de desmetilar m6A a partir de moléculas de RNA monocatenario in vitro. Esta proteína se acumula en gránulos citoplasmáticos que se colocalizan con siRNA bodies y se asocian a P-bodies, lo que sugiere que su actividad podría estar relacionada con el silenciamiento y/o degradación de mRNA. Por otro lado, ensayos preliminares muestran que los RNAs del AMV, el virus del mosaico del pepino (CMV), el virus de la arruga del nabo (TCV) y el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) se metilan durante la infección en Arabidopsis. Además, para AMV y CMV, los resultados fueron corroborados por UPLC-PDA-Tof-MS y los sitios m6A a lo largo de los RNAs del AMV fueron identificados mediante MeRIP-seq. Los resultados presentados confirman que la relación m6A/A a lo largo de los RNAs virales aumenta en plantas atalkbh9b en comparación con las silvestres, mientras que la traducción y/o replicación se ven afectadas y el movimiento sistémico a los tallos florales está prácticamente bloqueado. A diferencia de la CP de AMV, la de CMV no interacciona con atALKBH9B por Y2H y, como ocurre con el resto de virus analizados (CMV, TCV y CaMV), su ciclo de infección no se ve afectado en plantas atalkbh9b. Además, la secuenciación de mRNA realizada en este trabajo revela que la infección por AMV induce algunos genes de Arabidopsis pertenecientes a la maquinaria m6A, MTA, MTB, VIR y ECT5. De acuerdo con el efecto antiviral dependiente de m6A para el AMV y teniendo en cuenta que ECT2, ECT3 y ECT4 fueron recientemente caracterizadas como readers citoplasmáticas, la supresión del módulo ECT2/ECT3/ECT5 aumenta significativamente los títulos sistémicos de AMV y CMV. El efecto antiviral de ECT2 sobre AMV parece estar modulado por su unión directa a los residuos de m6A presentes en los RNAs virales, ya que un mutante de ECT2 defectuoso en el reconocimiento de m6A pierde la actividad antiviral que sí presenta la proteína original y no es capaz de arrastrar RNAs virales in vivo. Por otro lado, acorde a la localización previamente descrita para ECT2 y ECT4 y la capacidad de ECT2 para experimentar una fase similar al gel in vitro, la expresión transitoria de ECT5 muestra un patrón citoplasmático con formación de agregados. Se propone que, como se ha descrito para las proteínas YTH de mamíferos, la interacción entre las ECTs y el RNA polimetilado (en este caso, RNA viral) promovería la formación de gránulos de estrés y, en consecuencia, reduciría las tasas de traducción y replicación viral. En resumen, en este trabajo se caracteriza la primera m6A eraser de plantas, atALKBH9B, y, por primera vez, se describe la influencia del mecanismo de metilación m6A en las infecciones virales de plantas. / [EN] Post-transcriptional chemical modifications entail a new level of gene expression modulation. At the beginning of this Thesis, some components of the N6-adenosine methylation (m6A) complex had been characterized in plants, whereas 13 homologs of AlkB (atALKBH1-10B) - putative demethylases (or erasers) - and 13 proteins of the YTH family (ECT1-11, AT4G11970 and CPSF30) had been identified in the Arabidopsis genome. However, unlike mammals and yeast, no functional roles had been described for any of these proteins. Besides, several reports have brought to light the presence of m6A residues in viral RNAs from mammalian viruses and the critical roles that this modification plays regulating viral infections. However, the potential relevance of this molecular mechanism on plant viral infections remained fully unexplored.
The discovery of the interaction between the AMV CP and an Arabidopsis protein (atALKBH9B) with similarity to a human eraser was the starting point of this Thesis. Here, this interaction is confirmed and it is demonstrated that atALKBH9B can also recognize the viral RNAs. Furthermore, the obtained results prove that atALKBH9B has the capability of demethylating m6A from single-stranded RNA molecules in vitro. This protein was observed to accumulate in cytoplasmic granules that colocalize with siRNA-bodies and associate to P-bodies, suggesting that atALKBH9B activity could be related to mRNA silencing and/or decay processes. On the other hand, preliminary assays show that viral RNAs of AMV, Cucumber mosaic virus (CMV), Turnip crinkle virus (TCV) and Cauliflower mosaic virus (CaMV) become methylated during infection in Arabidopsis. Besides, for AMV and CMV, the results were corroborated by UPLC-PDA-Tof-MS and m6A sites along the RNAs of AMV were identified through MeRIP-seq approach. The results presented here confirm that m6A/A ratio along viral RNAs is increased in atalkbh9b plants compared to wild type, whereas translation and/or replication are impaired and systemic movement to the floral stems is practically blocked. In contrast to AMV, CMV CP does not interact with atALKBH9B by Y2H and, as it occurs with the rest of the assayed viruses (CMV, TCV and CaMV), its infection cycle is not affected in atalkbh9b plants.
Furthermore, the mRNA-seq analysis performed in this Thesis reveals that some Arabidopsis factors belonging to the m6A machinery, MTA, MTB, VIR and ECT5 genes, are upregulated upon AMV infection. Consistent with the m6A-dependent antiviral effect for AMV and considering that ECT2, ECT3 and ECT4 were recently characterized as cytoplasmic m6A readers, mutations of ECT2/ECT3/ECT5 Arabidopsis module significantly increase AMV and CMV systemic titers. The antiviral effect of ECT2 on AMV seems to be modulated via its direct binding to the m6A residues presented in the viral RNAs, since an ECT2 mutant defective in m6A recognition loses wild type antiviral activity and is not able to pull down viral RNAs in vivo. On the other hand, according to the previous subcellular localization described for ECT2 and ECT4 and the ability of ECT2 to undergo gel-like phase in vitro, the transitory expression of ECT5 displays a cytoplasmic pattern with the formation of some aggregates. As found for mammal YTH proteins, the interaction between ECTs and poly-methylated RNA (in this case viral RNA) is proposed to promote the formation of stress granules and, consequently, reduce viral translation and replication rates.
In summary, in this work, atALKBH9B is reported as the first m6A eraser identified in plants and, for the first time, it is described the influence of m6A methylation mechanism in plant viral infections. / [CA] Les modificacions químiques post-transcripcionals impliquen un nou nivell de modulació de l'expressió gènica. Al començament d'esta Tesi, s'havien caracteritzat alguns components del complex de metilació del nitrogen en posició 6 de la adenosina (m6A) en plantes. No obstant això, a diferència de mamífers i llevat, cap dels 13 homòlegs d'AlkB (atALKBH1-10B) - potencials desmetilases (o erasers) - i les 13 proteïnes de la família YTH (ECT1- 11, AT4G11970 i CPSF30) - potencials proteïnes de reconeixement de m6A (o readers) - identificades en el genoma d'Arabidopsis s'havien caracteritzat funcionalment. A més, diversos estudis han descrit la presència de residus m6A en RNAs de virus de mamífers i les diferents funcions que exercix esta modificació en la regulació de les infeccions virals. No obstant això, no s'ha estudiat la possible implicació d'este mecanisme molecular en les infeccions virals de plantes. El descobriment de la interacció entre la CP del virus del mosaic de l'alfals (AMV) i una proteïna d'Arabidopsis (atALKBH9B) amb homologia a una eraser humana va ser el punt de partida d'esta Tesi. En este treball es confirma esta interacció, i es demostra que atALKBH9B també pot reconéixer els RNAs virals. Els resultats revelen que atALKBH9B té la capacitat de desmetilar m6A a partir de molècules de RNA monocatenari in vitro. Esta proteïna s'acumula en grànuls citoplasmàtics que es colocalitzen amb siRNA bodies i s'associen a P-bodies, la qual cosa suggerix que l'activitat atALKBH9B podria estar relacionada amb els processos de silenciament i/o degradació de mRNA. D'altra banda, assajos preliminars mostren que els RNAs virals de l'AMV, el virus del mosaic del cogombre (CMV), el virus de l'arruga del nap (TCV) i el virus del mosaic de la coliflor (CaMV) es metilen durant la infecció en Arabidopsis. A més, per AMV i CMV els resultats van ser confirmats per UPLC-PDA-Tof-MS i els llocs m6A al llarg dels RNAs d'AMV s'identificaren mitjançant MeRIP-seq. Els resultats presentats confirmen que la relació m6A/A al llarg dels RNAs virals augmenta en les plantes atalkbh9b en comparació amb les silvestres, mentre que la traducció i/o replicació es veuen afectades i el moviment sistèmic a les tiges florals està pràcticament bloquejat. A diferència de la CP d'AMV, la de CMV no interacciona amb atALKBH9B per Y2H i, com ocorre amb la resta dels virus analitzats (CMV, TCV i CaMV), el seu cicle d'infecció no es veu afectat en plantes atalkbh9b. A més, la seqüenciació de mRNA realitzada en este treball revela que la infecció per AMV indueix alguns gens d'Arabidopsis pertanyents a la maquinària m6A, MTA, MTB, VIR i ECT5. D'acord amb l'efecte antiviral dependent de m6A per a l'AMV i tenint en compte que ECT2, ECT3 i ECT4 van ser recentment caracteritzades com readers citoplasmàtiques, la supressió del mòdul ECT2/ECT3/ECT5 augmenta significativament els títols sistèmics d'AMV i CMV. L'efecte antiviral d'ECT2 sobre AMV sembla estar modulat a través de la seua unió directa als nucleòtids m6A presents en els RNAs virals, ja que un mutant de la proteïna ECT2 defectuós en el reconeixement de m6A perd l'activitat antiviral que sí que presenta la proteïna original i no és capaç d'arrossegar RNAs virals in vivo. D'altra banda, d'acord amb la localització subcel·lular descrita prèviament per a ECT2 i ECT4 i la capacitat d'ECT2 per a experimentar una fase similar al gel in vitro, l'expressió transitòria d'ECT5 mostra un patró citoplasmàtic amb la formació d'agregats. Es proposa que, com s'ha descrit per a les proteïnes YTH de mamífers, la interacció entre les ECTs i el RNA polimetilat (en aquest cas, RNA viral) promouria la formació de grànuls d'estrès i, en conseqüència, reduiria les taxes de traducció i replicació viral. En resum, en este treball es caracteritza la primera m6A eraser de plantes, atALKBH9B, i, per primera vegada, es descriu la influència de l'mecanisme de metilació M6A en les infeccions virals de plantes. / Martínez Pérez, M. (2020). Involvement of the host RNA N6-adenosine methylation (m6A) pathway in the infection cycle of Alfalfa mosaic virus [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/155976
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/155976 |
| Date | 27 November 2020 |
| Creators | Martínez Pérez, Mireya |
| Contributors | Aparicio Herrero, Frederic, Pallás Benet, Vicente, Sanchez Navarro, Jesus Angel, Universitat Politècnica de València. Departamento de Biotecnología - Departament de Biotecnologia |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.2212 seconds