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Previous issue date: 2017-02-14 / L-asparaginase (ASNase) is used in the treatment of acute lymphoid leukemia, the medicines contain ASNase of prokaryotic origin and the disadvantage of its use are the hypersensitivity reactions, this study had the objective of the evaluation of filamentous fungi for production of enzyme, representing a eukaryotic source. 32 filamentous fungi isolated from the Caatinga biome, through qualitative screening, using bromothymol as indicator and quantitative screening in two stages in modified Czapek Dox medium, using both culture fluid and mycelium to determine the enzymatic activity through L-aspartyl-β-hydroxamic acid (ABA) method. Characterization of Aspergillus terreus S-18 growth was carried out, the kinetic parameters {maximum growth rate (μMax), doubling time (Td) and substrate conversion factor in cells (g.g)} and optimization of biomass and enzyme production By the best producer through statistical planning divided into three blocks with repetition of the central point in two stages of cultivation, recovery of the intracellular enzyme through mechanical disruption of the mycelium, besides cultivation in an air- lift bioreactor (adapted) to evaluate the influence of the inoculum in the production of ASNase, using inoculum with spores and pre-inoculum cultured in rotativo shaker. A total of 15 fungi produced ASNase in qualitative screening, all of which produced the extracellular enzyme but the intracellular production of ASNase was higher when compared to extracellular production, and 9 fungi produced the intracellular enzyme in the quantitative screening with emphasis on intracellular production of Aspergillus Terreus S-18, which was 1.58 U.g-1 (18.2 U total) for ASNase and 0.15 U.g-1 for L- glutaminase (GLUase), showing ASNase/GLUase ratio of 10.5. In the kinetic parameters A. terreus S-18 had μMax of 0.019 h-1 , Td of 36.5 h and substrate conversion factor in cells in the growth phase of 0.9 g.g-1. In the optimization of biomass and ASNase production by A. terreus S-18, the optimum values defined for biomass production: pH 5.7 and temperature of 29 °C, already for enzyme production: pH 7.0, inoculum of 3.24E+07 spores.mL-1 and temperature of 29 °C, resulting in the production of 69.3 U total of ASNase. In the recovery of the enzyme, 0.8 U.mL-1 activity was obtained using cell disruption by glass beads and vortex. In the bioreactor cultivation, the inoculum using spores did not result in the production of extracellular and / or intracellular ASNase, and the culture using pellets of the fungus A. terreus S-18 was able to produce the intracellular enzyme, corresponding to 109.7 total U ASNase. / A enzima L-asparaginase (ASNase) é utilizada no tratamento de leucemia linfoide aguda, sendo que os medicamentos comerciais contém ASNase de origem procariótica e a principal desvantagem de seu uso são as reações de hipersensibilidade. Diante disso, este trabalho teve como objetivo a avaliação da produção de L-asparaginase por fungos filamentosos, representando uma fonte eucariótica alternativa para esta enzima. Foram avaliados 32 fungos isolados do bioma Caatinga no sertão Paraibano quanto à capacidade de produção da L- asparaginase. Inicialmente foi realizado o screening qualitativo por meio da utilização do azul de bromotimol como indicador. Os fungos selecionados nessa primeira etapa foram cultivados em meio Czapek Dox modificado para determinação da atividade enzimática, tanto intra quanto extracelular. Para determinar a atividade enzimática foi utilizado método do ácido L-aspartil- -hidroxâmico (ABA) e o Aspergillus terreus S-18 foi definido como a melhor cepa produtora. Obteve-se a caracterização dos perfis de crescimento fúngico e produção da enzima com subsquente otimização da produção de biomassa e da enzima por meio de planejamento estatístico dividido em três blocos com repetição do ponto central. Avaliou-se também a recuperação da enzima intracelular por meio do rompimento mecânico do micélio e aumento na escala de produção por meio do cultivo em biorreator air-lift (adaptado). Foram selecionados 15 fungos após o screening qualitativo. A produção intracelular de ASNase foi maior quando comparada a produção extracelular, sendo que 9 fungos produziram a enzima intracelular no screening quantitativo com destaque para produção intracelular do A. terreus S-18, que foi de 1,58 U.g-1 (18,2 U totais) para ASNase e 0,15 U.g-1 para L-glutaminase (GLUase), apresentando relação ASNase/GLUase de 10,5. Nos cálculos dos parâmetros cinéticos o A. terreus S-18 apresentou µMax de 0,019 h-1, Td de 36,5 h e fator de conversão de substrato em células, na fase de crescimento, de 0,9 g.g-1. Na otimização da produção de biomassa e de ASNase por A. terreus S-18, os valores ótimos para produção de biomassa: pH de 5,7 e temperatura de 29 °C e para produção da enzima: pH de 7,0, inóculo de 3,24E+07 esporos.mL-1 e temperatura de 29 °C, resultando na produção de 69,3 U totais de ASNase. Na recuperação da enzima obteve-se atividade de 0,8 U.mL-1 por rompimento celular por pérolas de vidro e vórtex. Em biorreator, o inóculo utilizando esporos não resultou em produção de ASNase extracelular e/ou intracelular, já o cultivo utilizando pellets o fungo A. terreus S-18 foi capaz de produzir a enzima intracelular, correspondente a 109,7 U totais de ASNase.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.bc.uepb.edu.br:tede/2761 |
| Date | 14 February 2017 |
| Creators | Rocha, Wilma Raianny Vieira da |
| Contributors | Alves, Harley da Silva, Silva, Tales Alexandre da Costa e, Santiago, Angela Maria, Coelho, Glauciane Danusa |
| Publisher | Universidade Estadual da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - PPGCF, UEPB, Brasil, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa - PRPGP |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UEPB, instname:Universidade Estadual da Paraíba, instacron:UEPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8157968555251876874, 600, 600, 600, 524871450381110278, 6997636413449754996 |
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