Introdução O sistema dos fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGF) desempenha importante papel no crescimento e desenvolvimento celular normal. Hiperexpressão do gene IGF1R tem sido demonstrada em diversos tumores, sugerindo que a expressão deste receptor represente um pré-requisito fundamental para transformação celular. Nosso grupo de pesquisa demonstrou o aumento de expressão de IGF1R em tumores adrenocorticais pediátricos. Objetivos: Induzir o silenciamento do gene IGF1R por siRNA na linhagem de tumor adrenocortical humano NCI H295R, bem como avaliar os efeitos in vitro por meio da análise de proliferação celular e apoptose desta linhagem celular. Adicionalmente, avaliar a expressão de IGF-1R e de microRNAs relacionados a sua transcrição em tumores adrenocorticais humanos. Pacientes e métodos: A linhagem celular de carcinoma adrenocortical humano NCI H295R foi cultivada e submetida ao tratamento com 2 siRNAs específicos para IGF-1R. Todos os experimentos foram realizados em quatro grupos: (1) células não tratadas com siRNA, (2) células tratadas com siRNA # 1, (3) células tratadas com siRNA # 2 e (4) células tratadas com o siRNA controle negativo. A expressão gênica e proteica de IGF-1R foram determinadas por meio das técnicas de PCR em tempo real e Western Blot, respectivamente. Os efeitos do silenciamento de IGF-1R in vitro foram avaliados por ensaios de proliferação celular e análise de atividade de caspases. Além disso, 202 pacientes com tumor adrenocortical foram selecionados para o estudo de expressão proteica de IGF-1R por imunohistoquímica. Para avaliação de expressão de microRNAs relacionados à expressão de IGF-1R (miR-100, 375, 145 e 126) por PCR em tempo real foram selecionados 32 pacientes dos 202 disponíveis. Resultados: A expressão de IGF-1R foi significantemente diminuída nas células tratadas com siRNA # 1 e siRNA # 2. Os valores relativos de RNA mensageiro de IGF1R diminuíram aproximadamente 50% e as análises de Western Blot revelaram uma redução de 30% na proteína de IGF-1R. A diminuição de expressão foi acompanhada por uma redução de 40% na taxa de crescimento celular in vitro e um aumento de 45% das taxas de apoptose. A análise de expressão dos microRNAs 100, 375, 145 e 126 demostrou que a expressão de IGF-1R não se correlaciona com a expressão destes RNAs pequenos. Adicionalmente, a análise de expressão proteica de IGF-1R em tumores adrenocorticais humanos revelou que expressão forte (20%) de IGF-1R foi mais comum em carcinomas de adultos. Além disso, a imunolocalização do IGF-1R nos carcinomas (19%) foi mais frequentemente nuclear em relação aos adenomas de adultos. Conclusões: Os dados obtidos reforçam a importância de IGF-1R nas vias tumorigênicas das neoplasias malignas do córtex da glândula suprarrenal. A inibição deste receptor foi capaz de inibir o crescimento tumoral in vitro por meio da redução das taxas de proliferação celular e aumento da apoptose em linhagem celular de carcinoma adrenocortical humano. Além disso, a expressão proteica nuclear de IGF-1R foi mais comum entre os carcinomas, sugerindo representar um marcador biológico desta neoplasia / Introduction: The insulin-like growth factor (IGF) system plays a key role in normal cell growth and development. IGF1R overexpression has been demonstrated in several tumors suggesting that its expression is a prerequisite for cell transformation. We demonstrated IGF1R overexpression in pediatric adrenocortical tumors. Objectives: To induce IGF1R silencing by siRNA in a human adrenocortical cell line NCI H295R and evaluate its effects on cell proliferation and apoptosis. Additionally, evaluate the expression of IGF-1R protein and microRNAs related to its transcription in human adrenocortical tumors. Patients and methods: The human adrenocortical tumor cell line NCI H295R was cultured and treated with 2 specific IGF1R siRNA. All experiments were carried out in four groups: (1) untreated NCI H295R cells, (2) NCI H295R cells transfected with specific IGF1R siRNA # 1, (3) NCI H295R cells transfected with specific IGF1R siRNA # 2 and (4) NCI H295R cells transfected with a negative control. IGF-1R gene and protein expression was determined by the techniques of real-time PCR and Western blot, respectively. We assessed the effects of IGF-1R silencing on cell proliferation and apoptosis. Moreover, 202 patients with adrenocortical tumors were selected for the study of IGF-1R protein expression by immunohistochemistry. In the analysis of microRNAs that are related to IGF1R (miR-100, 375, 145 e 126) by real time PCR, 32 out 202 patients were selected. Results: IGF-1R levels were significantly decreased in cells that were treated with IGF-1R siRNA # 1 and siRNA # 2. The relative values of IGF1R mRNA decreased approximately 50% and Western blot analysis revealed a 30% of reduction in IGF-1R protein. Downregulation of this gene was accompanied by a reduction in 40% of cell growth in vitro and an increase in 45% of apoptosis. The analysis of microRNAs demonstrated that IGF1R expression is not correlated with the expression of these small RNAs. Additionally, the analysis of IGF-1R protein expression in human adrenocortical tumors revealed that strong expression (20%) of IGF-1R was more common in adult carcinomas. Moreover, the nuclear IGF-1R was more frequent in carcinomas diagnosed in adults (19%) when compared to adenomas. Conclusions: These data demonstrate the importance of IGF-1R in tumorigenic pathways of malignant neoplasms of the adrenocortical gland. IGF-1R silencing could inhibit tumor growth in vitro by reducing cell proliferation and increasing apoptosis in a cell line of human adrenocortical carcinoma. Furthermore, nuclear IGF-1R expression was more frequent in carcinomas diagnosed in adults, suggesting that IGF-1R may be a biological marker of this neoplasia
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-16032015-161040 |
| Date | 12 January 2015 |
| Creators | Ribeiro, Tamaya Castro |
| Contributors | Xavier, Ana Claudia Latrônico |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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