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Previous issue date: 2008-05-26 / Animal cloning has been associated with developmental abnormalities, with the level of heteroplasmy caused by the procedure per se being one of the potential determining factors for the appearance of the problems. Embryo aggregation may be an alternative to minimize such effects during cloning. The aim of this study was to determine the effect of the heteroplasmy caused by fusion of hemi-cytoplasts or by aggregation of hemi-embryos, varying the final cytoplasmic volume, on development and cell density of embryos produced by handmade cloning (HMC), parthenogenesis or in vitro fertilization (IVF). In vitro-matured bovine oocytes, selected by the presence of a polar body, were manually bisected, followed by fluorescence screening of hemi-cytoplasts. One or two enucleated hemi-cytoplasts were paired and fused with one skin somatic cell. Activated clone and zona-free parthenote embryos and hemi-embryos were in vitro-cultured in microwells (WOW system), being allocated to one of six experimental groups, based on the volume of cytoplasm used for embryo reconstruction either by fusion of hemi-cytoplasts or by aggregation of hemi-embryos or embryo, on a per WOW basis, as follows: single clone or parthenote hemi-embryos (G1: 1 x 50%); aggregation of two (G2: 2 x 50%), three (G3: 3 x 50%) or four (G4: 4 x 50%) clone or parthenote hemi-embryos; single clone or parthenote embryos (G5: 1 x 100%); or aggregation of two clone or parthenote embryos (G6: 2 x 100%). Zona-intact parthenote or IVF embryos (G7: Zona-intact, 100%), used as controls, were in vitro-cultured in 4-well dishes. Data were analyzed by χ2, ANOVA, Pearson s correlation or linear regression, for P<0.05. In general, results indicated that the increase in the number of aggregated structures within each WOW was followed by a linear increase in cleavage, blastocyst rate and cell density. Even though those observations were more pronounced in parthenotes, cell density and embryo quality were superior in clone embryos. The increase in cytoplasmic volume, either by fusion or by aggregation, had a positive effect on embryo development, supporting the establishment of pregnancies after transfer to female recipients. Nevertheless, the use of only half of the normal volume did not affect the developmental potential to the blastocyst stage, but reduced cell number. In conclusion, despite the increase in embryo development and cell density per WOW, embryo aggregation did not improve blastocyst yield or cell number, on a hemi-cytoplast basis / A clonagem animal tem sido associada a anormalidades de desenvolvimento, com o nível de heteroplasmia causados pela técnica per se sendo um dos potenciais fatores determinantes do aparecimento dos problemas. A agregação embrionária pode ser uma alternativa para minimizar tais efeitos causados pela clonagem. O objetivo deste estudo foi determinar o efeito da heteroplasmia pela fusão de hemi-citoplastos ou da agregação de hemi-embriões, variando-se o volume citoplasmático final, no desenvolvimento e na densidade celular de embriões produzidos por handmade cloning (HMC), partenogênese ou fecundação in vitro (FIV). Oócitos bovinos maturados in vitro, selecionados pela presença do corpúsculo polar, foram bisseccionados manualmente, seguidos da seleção de hemi-citoplastos por fluorescência. Um ou dois hemi-citoplastos enucleados foram pareados e fusionados a uma célula somática cutânea. Embriões e hemi-embriões de clonagem e de partenogênese (sem zona pelúcida) foram ativados e cultivados in vitro em micropoços (sistema WOW), sendo alocados para um de seis grupos experimentais, baseado no volume de citoplasma utilizado para a reconstrução embrionária pela fusão de hemi-citoplastos ou agregação de hemi-embriões e embriões, por micropoço (WOW), conforme a seguir: um único hemi-embrião de clonagem ou de partenogênese (G1: 1 x 50%); agregação de dois (G2: 2 x 50%), três (G3: 3 x 50%) ou quatro (G4: 4 x 50%) hemi-embriões de clonagem ou de partenogênese; um único embrião de clonagem ou de partenogênese (G5: 1 x 100%); ou agregação de dois embriões de clonagem ou de partenogênese (G6: 2 x 100%). Embriões intactos oriundos de FIV ou de partenogênese (G7: Zona intacta, 100%), utilizados como controle, foram cultivados in vitro em placas de 4 poços. Os resultados foram analisados pelos testes do χ2, ANOVA, correlação de Pearson ou regressão linear, para P<0.05. Em termos gerais, os resultados indicaram que o aumento no número de estruturas agregadas em cada micropoço foi seguido por um aumento linear nas taxas de clivagem, de blastocisto e na densidade celular. Mesmo que tais observações tenham sido mais pronunciadas nos partenotos, a densidade celular e a qualidade embrionária foram superiores em embriões clonados. O aumento no volume citoplasmático por fusão ou agregação apresentou um efeito positivo no desenvolvimento embrionário, dando suporte ao estabelecimento de prenhezes após a transferência para fêmeas receptoras. No entanto, a utilização de apenas metade do volume normal não afetou o potencial de desenvolvimento até o estádio de blastocisto, mas reduziu o número de células. Em conclusão, apesar de haver um aumento no desenvolvimento e densidade celular em embriões por micropoço, a agregação embrionária não melhorou a taxa de blastocistos ou o número de células, com base no número de hemi-citoplastos utilizados por embrião
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/811 |
| Date | 26 May 2008 |
| Creators | Ortigari Júnior, Ivens |
| Contributors | Bertolini, Marcelo |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Ciência Animal, UDESC, BR, Ciências Veterinárias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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