Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study concerning the lifelong dynamic of undifferentiated cell populations present in the organism expanded the therapeutics frontiers aiming to healing several kinds of wounds and diseases. Different cell populations have been used for this purpose, as those derived from pre-implantation embryos, called embryonic stem cells (ESC); those derived from pluripotent somatic cells niches, responsible for organic regeneration throughout life, named adult stem cells (ASC); and cells derived from the bone marrow mononuclear fraction (BMNC), which has ASC and hematopoietic lineage cells at different stages of differentiation. Important barriers have been overcome aiming to elucidate benefits and risks inherent to cell therapy. However, the knowledge derives from an evolution process fraught with doubts, and there are many things to be unveiled for safe exploration of different kinds of cell therapy, mainly when allogeneic cells are used. Toxoplasmosis is an opportunistic zoonosis caused by the protozoan Toxoplasma gondii, which has a worldwide distribution and affects about a third of the human population. In the acute infection, T. gondii tachyzoites spread up and multiply themselves into host cells. Immune response leads to evasion of the protozoan in tissue cysts of (semi-latent) bradyzoites, mantaining the chronic infection of the host. Immunosuppression, as used in conditioning for allogeneic cells transplantation, is a risk factor for toxoplasmosis reactivation in chronically infected hosts. The studies presented in this thesis were performed aiming to contribute with: a. methods used for molecular detection of allogeneic cells after systemic transplantation by endovenous injection, allowing to mapping the organic distribution and the fate of these cells in recipient body; and b. understanding about interrelationships among conditioning (pharmacological immunosuppression) for transplantation, allogeneic cell therapy with BMNC and toxoplasmosis reactivation in chronically infected hosts. The study described in the Chapter 1 shows a nested-PCR test with increased sensitivity and assurance for molecular diagnosis of presence or absence of male mice cells in body fluids and tissues of female recipients after intravenous transplantation. This method, based on detection of specific DNA fragment from the Y chromosome, was effective for cells from two distinct populations: BMNC and in vitro cultured cells derived from adipose tissue. Therefore, this method can be suitable for other cell types. The study presented in the Chapter 2 shows the effects caused by an immunosuppressive pharmacological regimen with high doses of busulfan and cyclophosphamide (PCT), followed by allogeneic BMNC transplantation in a model of chronic toxoplasmosis in mice. This study was divided in three subsequent steps: I. experimental infection with type II cystogenic strain of T. gondii (ME-49) and characterization of acute and chronic toxoplasmosis; II. evaluation of the pharmacological immunosuppression effects in female Balb/c; and III. evaluation of the effects resulting from transplantation of male mice BMNC to recipient females. The pharmacological immunosuppression caused worsening of the general clinical condition of the animals and high mortality rates. This effect occurred remarkably earlier in animals chronically infected with T. gondii, showing the high risk of the combination between persistent toxoplasmosis and pharmacological immunosuppression in conditioning for allogeneic transplantation. This study showed the safety of the allogeneic BMNC transplantation in female Balb/c independently of the infection by T. gondii, provided that they have not been subjected to conditioning regimen before transplantation. In the Chapter 3, a pharmacological immunosuppressive regimen, with reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd), was tested as an alternative to minimize conditioning regimen inherent risks in mice chronically infected with T. gondii and submitted to allogeneic transplantation of BMNC. This study was also divided in three sequential steps: I. oral infection of female Balb/c with tissue cysts of T. gondii (cystogenic VEG strain) and monitoring over a 120 days period (chronic toxoplasmosis); II. evaluation of conditioning regimen effects using reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd); III. endovenous transplantation of allogeneic BMNC from male donors to the female Balb/c. The results showed the safety of the PCTrd for use in female Balb/c chronically infected with T. gondii. Reduced doses of busulfan and cyclophosphamide (PCTrd) resulted in lower incidence and intensity of clinical signs and absence of mortality, in contrast to results that were observed with high doses (PCT) recommended for myeloablation. Transplantation of allogeneic bone marrow-derived mononuclear cells from male donors was safe in the short term for female Balb/c mice submitted to PCTrd regardless of persistent infection by T. gondii. / O estudo da dinâmica das populações celulares indiferenciadas, presentes no organismo ao longo da vida, ampliou a fronteira de alternativas para o tratamento de vários tipos de lesões e de doenças. Diversas populações celulares têm sido usadas para isso, como as derivadas de embriões em fase de pré-implantação, denominadas células-tronco embrionárias (CTE); as derivadas de nichos de células somáticas pluripotentes, responsáveis pela regeneração dos tecidos orgânicos ao longo da vida, chamadas de células-tronco adultas (CTA); e as células da fração mononuclear da medula óssea (CFMO), que conta com CTA e células da linhagem hematopoiética em variados estágios de diferenciação. Importantes obstáculos têm sido superados no que se refere ao conhecimento de benefícios e de riscos inerentes à terapia celular. Contudo, a construção do conhecimento é permeada de dúvidas e há muito a ser desvendado para que se possam explorar com segurança as potencialidades das terapias celulares, especialmente usando células alogênicas. A toxoplasmose é uma zoonose oportunista causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, que apresenta distribuição mundial e acomete cerca de um terço da população humana. Na fase aguda da infecção, taquizoítos de T. gondii disseminam-se e multiplicam-se nas células hospedeiras. A resposta imune induz a evasão do protozoário em cistos teciduais de bradizoítos (forma de semilatência), mantendo o hospedeiro cronicamente infectado. A imunossupressão, como a utilizada no pré-condicionamento para transplante de células alogênicas, é um fator de risco de reativação da toxoplasmose em portadores crônicos. Na presente tese, são apresentados estudos realizados com objetivo de contribuir com: a. métodos de detecção molecular de células alogênicas após o transplante sistêmico pela via endovenosa, permitindo o mapeamento da distribuição e do destino destas células no organismo receptor; e b. compreensão das inter-relações envolvendo pré-condicionamento (imunossupressão farmacológica) para o transplante, terapia celular alogênica com CFMO e reativação da toxoplasmose em portadores crônicos. No Capítulo 1 demonstra-se uma nested-PCR que aumenta a sensibilidade e a segurança do diagnóstico molecular de presença ou ausência de células de camundongos machos em fluidos e tecidos de receptoras fêmeas após transplante endovenoso. O método, que envolve a detecção de fragmento de DNA específico do cromossomo Y, foi eficaz para células de duas populações distintas: CFMO e células cultivadas in vitro derivadas do tecido adiposo. Portanto, o método pode ser útil para outros tipos celulares. O estudo apresentado no Capítulo 2 demonstra os efeitos de um protocolo de imunossupressão farmacológica com altas doses de busulfan e ciclofosfamida (PCT), seguido do transplante alogênico de CFMO em um modelo de toxoplasmose crônica em camundongos. Esse estudo foi dividido em três etapas subsequentes: I. infecção experimental com cepa cistogênica do tipo II de T. gondii (ME-49) e caracterização da toxoplasmose aguda e crônica; II. avaliação dos efeitos da imunossupressão farmacológica nas fêmeas Balb/c; e III. avaliação dos efeitos do transplante de CFMO de camundongos machos para as fêmeas receptoras. A imunossupressão farmacológica provocou agravamento do quadro clínico geral dos animais e altas taxas de mortalidade. Esse efeito foi notavelmente precoce nos animais cronicamente infectados por T. gondii, demonstrando o alto risco da combinação entre toxoplasmose persistente e imunossupressão farmacológica na preparação para o transplante alogênico. Demonstrou-se a segurança do transplante alogênico de CFMO em fêmeas Balb/c infectadas ou livres de infecção por T. gondii, desde que não tenham sido submetidas ao protocolo de pré-condicionamento para o transplante. No Capítulo 3, um regime de imunossupressão farmacológica com doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr) foi testado como alternativa para minimizar os riscos inerentes ao pré-condicionamento em camundongos cronicamente infectados com T. gondii e submetidos ao transplante alogênico de CFMO. Esse estudo também foi dividido em três etapas sequenciais: I. infecção oral de fêmeas Balb/c com cistos teciduais de T. gondii (cepa VEG, cistogênica) e monitoramento durante um período de 120 dias (toxoplasmose crônica); II. avaliação dos efeitos do regime de pré-condicionamento, com doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr); III. transplante alogênico endovenoso de CFMO de doadores machos para as fêmeas Balb/c. Os resultados demonstraram a segurança do PCTdr para uso em Balb/c fêmeas cronicamente infectadas com T. gondii. Doses reduzidas de busulfan e ciclofosfamida (PCTdr) resultaram em menor incidência e intensidade de sinais clínicos e ausência de mortalidade, em oposição ao ocorrido com as altas doses (PCT) recomendadas para mieloablação. O transplante alogênico de células mononucleares da medula óssea de doadores machos foi seguro no curto prazo em fêmeas Balb/c submetidas ao PCTdr, independentemente de infecção persistente pelo T. gondii.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsm.br:1/4103 |
| Date | 08 August 2014 |
| Creators | Cezar, Alfredo Skrebsky |
| Contributors | Gonçalves, Paulo Bayard Dias, Vogel, Fernanda Silveira Flôres, Antoniazzi, Alfredo Quites, Comim, Fabio Vasconcellos, Lübeck, Irina, Krause, Luciana Maria Fontanari |
| Publisher | Universidade Federal de Santa Maria, Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária, UFSM, BR, Medicina Veterinária |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSM, instname:Universidade Federal de Santa Maria, instacron:UFSM |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 500500000007, 400, 300, 300, 300, 300, 300, 300, 300, fcd33ccc-f08d-428c-b7da-9d3757cf0a96, c5303dfe-a9dd-4df1-99e5-07c93d4691a8, 87a417ae-60eb-4318-9a6c-e38e8b3da5d6, 07e69e9e-c8e4-460c-91dd-f3b5aa4e560a, 1251088f-87d7-4b52-baa6-8e5739b3bf79, 7773c2bd-eef0-43f0-99d0-694a53a40601, a45db657-fbef-4efc-a2e6-1b1ebab5c203 |
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