O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico, que invade tecidos queratinizados causando infecções superficiais e cutâneas. Algumas drogas são usadas para o tratamento das dermatofitoses, sendo o ácido undecanóico (AUN) uma delas. O AUN é o mais tóxico dos ácidos graxos saturados de cadeia média, utilizado como medicamento de uso tópico. O estudo de expressão gênica e mecanismos regulatórios são fundamentais para ampliar o conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta à exposição a estes agentes citotóxicos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar os mecanismos moleculares envolvidos no processo adaptativo da exposição ao ácido undecanóico, através da análise global do transcriptoma e mecanismos regulatórios como o processamento alternativo. Para tanto o micélio de T.rubrum foi submetido ao ácido undecanóico por 3 e 12 h de exposição, em triplicata biológica, e o RNA resultante foi submetido ao sequenciamento por RNAseq. O sequenciamento gerou aproximadamente 58 milhões de reads por biblioteca, as quais foram filtradas e alinhadas com o genoma de referência utilizando-se os softwares FASTQC e bowtie2, respectivamente. A análise de expressão gênica diferencial foi feita por meio do pacote do Bioconductor DESeq e, para esta análise, foi utilizada a amostra de 0h como referência. Foram identificados 492 genes diferencialmente expressos em resposta ao AUN, sendo 385 e 210 genes modulados em resposta a 3 e 12 horas de exposição, respectivamente. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares envolvendo transporte transmembrana, degradação de xenobióticos, metabolismo de lipídeos e aminoácidos, secreção de enzimas proteolíticas e patogênese, sugerindo que o AUN ativa duas principais vias de sobrevivência em resposta a este agente estressor, a degradação e o efluxo da droga. Posteriormente, foram realizadas as análises de processamento alternativo quanto ao uso diferencial de exons por meio do algoritmo HTSeq e DEXSeq e retenção de introns utilizando-se algoritmos construídos na linguagem Perl. Os genes envolvidos em algum tipo de processamento alternativo estão relacionados com funções metabólicas variadas como tradução, transporte vesicular, metabolismo lipídico, biogênese ribossomal, sequência de ligação ao DNA, regulação da transcrição e processamento do pré-mRNA. Estes resultados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta de sobrevivência perante a exposição ao AUN. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is a filamentous fungus, anthropophilic that invades keratinized tissue causing superficial infections on the skin. Some drugs are used for the treatment of dermatophytosis, being the undecanoic acid (AUN) one of them. The AUN the most toxic of the saturated medium chain fatty acids, is used as a topical medicine. The study of gene expression and the regulatory mechanisms are fundamental to understand the molecular mechanisms involved in response to exposure of these cytotoxic agents. So, the aim of this study was to characterize the molecular mechanisms involved in the adaptive process of the exposure to undecanoic acid, by the global analysis of the transcriptome and regulatory mechanisms such as alternative splicing. To this end, the mycelium of T. rubrum was exposed to undecanoic acid for 3 or 12 hours in biological triplicate, and the resulting RNA was sequenced by RNA-Seq. The sequencing generated approximately 58 million of reads per library, which were filtered and aligned with the reference genome using the softwares and Bowtie2 and FASTQC, respectively. The analysis of differential gene expression was performed through the Bioconductor package DESeq and, for this analysis, we used as reference sample the 0h time. We identified 492 differentially expressed genes in response to UDA, being 385 and 210 genes modulated in response to 3 and 12 hours of exposure, respectively. These genes are related to various cellular processes involving the transmembrane transport, xenobiotics degradation, lipids and amino acids metabolism, secretion of proteolytic enzymes and pathogenesis, suggesting the activation of two major survival pathways in response to this stressor, degradation and drug efflux, by UDA. Also, the alternative splicing analysis was performed through the differential use of exons using the algorithms HTSeq and DEXSeq and intron retention using algorithms built in Perl language. The genes involved in some kind of alternative splicing are associated with various metabolic functions such as translation, vesicular transport, lipid metabolism, ribosomal biogenesis, DNA binding sequence, transcription regulation and processing of pre-mRNA. These results contribute to increase the knowledge of the molecular mechanisms involved in the survival response upon exposure to the AUN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04012017-104024 |
| Date | 18 March 2016 |
| Creators | Mendes, Niege Silva |
| Contributors | Rossi Filho, Antonio |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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