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Previous issue date: 2017-02-08 / Com o desenvolvimento da ind?stria biotecnol?gica, ? crescente o interesse por ant?genos recombinantes purificados para obten??o de vacinas. Por?m, para essa aplica??o esses ant?genos precisam apresentar um elevado grau de pureza, e por isso ? de grande relev?ncia o desenvolvimento de t?cnicas que permitam a redu??o do n?mero de opera??es unit?rias necess?rias ao processo de purifica??o, permitindo ainda uma elevada recupera??o e proporcionando uma maior economia na obten??o dos bioprodutos. A Adsor??o em Leito Expandido (ALE) vem se destacando como uma alternativa prop?cia para o downstream processing, pois ? uma t?cnica cromatogr?fica de modo simples e de baixo custo, que integra as etapas de clarifica??o, concentra??o, purifica??o em uma ?nica opera??o. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar os m?todos de rompimento celular e os diferentes metais imobilizados em resina Streamline chelating para purifica??o do ant?geno 503 de Leishmania i. chagasi por ALE bem como remover os lipopolissacar?deos (LPS) liberados durante a etapa de rompimento celular. Primeiramente, foi avaliado qual o melhor m?todo de rompimento celular para obten??o da prote?na intracelular. As estrat?gias estudadas utilizando lisozima, p?rolas de vidro, ureia e EDTA foram avaliadas atrav?s de quatro planejamentos experimentais. Em seguida, foram realizados testes de adsor??o em batelada, utilizando-se cinco ?ons met?licos (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ e Fe3+) nas concentra??es de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L acoplados na resina Streamline chelating, escolhendo-se o metal que apresentou melhor adsor??o do ant?geno para os ensaios usando ALE. Posteriormente, foi estimada a quantidade m?nima de tensoativo Triton X-114 necess?ria na etapa de lavagem da ALE para remo??o do LPS, a fim de obter-se o ant?geno 503 livre desse contaminante. E por fim, foram realizados ensaios de ALE visando recuperar e purificar a prote?na de interesse. Para os ensaios usando ALE utilizou-se uma coluna de 2,6 cm de di?metro por 30 cm de altura, acoplada a uma bomba perist?ltica. Com os planejamentos experimentais realizados para avalia??o do rompimento celular, observou-se que maiores quantidades de prote?nas totais e do ant?geno 503 liberadas foram obtidas para o m?todo da ureia e que o ?nico fator significativo para esse planejamento foi a concentra??o, correspondente a 8,0 M. Como resultado para a triagem do ?on met?lico, o cobre (Cu2+) foi o metal que apresentou maior capacidade de adsor??o do ant?geno 503, apresentando valores de capacidade de adsor??o de 0,102, 0,128 e 0,111 mg/mL de adsorvente para as concentra??es de 0,1, 0,5 e 0,8 mol/L, respectivamente. Tem-se ainda que para as tr?s condi??es analisadas (0,01, 0,05 e 0,1 % de Triton X-114) na etapa de lavagem da ALE o percentual de remo??o de LPS foi elevado e que a concentra??o m?nima utilizada (0,01 %) j? foi suficiente para a remo??o de 99,70 % deste contaminante. Para o teste de ALE utilizando elui??o isocr?tica (0,6 M de imidazol) os resultados obtidos mostraram baixa recupera??o (3,0 %) do ant?geno 503. Avaliou-se ent?o a elui??o em degrau, inicialmente em dois passos, aplicando-se 0,6 mol/L e, em seguida, 1,0 mol/L de imidazol. Por?m, esta estrat?gia ainda n?o foi eficiente para recuperar a prote?na de interesse. Um novo ensaio foi realizado, com um total de tr?s passos de elui??o, utilizando 0,3 e 0,6 mol/L. Esse ?ltimo teste mostrou uma recupera??o de 15,0 % da prote?na de interesse e um fator de purifica??o de, aproximadamente, 3,0. Portanto, a t?cnica cromatogr?fica de afinidade por ?ons met?licos imobilizados (IMAC) mostrou ser uma alternativa eficiente na recupera??o e purifica??o do ant?geno 503 a partir do homogeneizado de E. coli n?o clarificado. / Due to the development of biotechnology industry, there is a growing interest in purified recombinant antigens to obtain vaccines. However, for this application these antigens require a high degree of purity, thus, it is of great relevance the development of techniques that allow the reduction in the number of unitary operations required for the purification process, this would also allow a high recovery and a greater saving in obtaining bioproducts. The Expanded Bed Adsorption (EBA) has shown as a suitable alternative for downstream processing, once it is a simple and low cost chromatographic technique that integrates clarification, concentration and purification in a single operation. This study aims at evaluating the methods of cell disruption and the different metals immobilized in Streamline Chelating resin for purification of Leishmania i. chagasi 503 antigen by EBA as well as removing the lipopolysaccharides (endotoxin) released during the stage of cell disruption. Firstly, the best method of cell disruption to obtain intracellular protein was evaluated. The strategies studied using lysozyme, glass beads, urea and EDTA were evaluated through four experimental designs. Then, batch adsorption tests were carried out using five metal ions (Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co2+ and Fe3+) at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M coupled in the Streamline chelating resin, selecting the metal that showed the best adsorption of the antigen for the assays using EBA. Then, the minimum amount of Triton X-114 tensioactive required in the EBA wash stage for LPS removal was estimated in order to obtain the 503 antigen free of this contaminant. Finally, EBA assays were performed in order to recover and purify the protein of interest. EBA experiments were carried out using a column of 2.6 cm in diameter (30 cm height), coupled to a peristaltic pump. The experimental plannings carried out to evaluate cell disruption, showed that higher amounts of total proteins and 503 antigen released were obtained for the urea method and that the only significant factor for this planning was the concentration corresponding to 8.0 M. As a result of the metal ion screening, copper (Cu2+) was the metal with the highest adsorption capacity of 503 antigen, presenting adsorption capacity values of 0.102, 0.128 and 0.111 mg / mL of adsorbent at concentrations of 0.1, 0.5 and 0.8 M, respectively. For the three analyzed conditions (0.01, 0.05 and 0.1% Triton X-114) in the EBA washing stage, the percentage of LPS removal was high and the minimum concentration used (0.01%) was enough to remove 99.70% of this contaminant. For the EBA test using isocratic elution (0.6 M imidazole) the results obtained showed a low recovery (3.0 %) of the 503 antigen. The step elution was then evaluated, initially in two steps, applying 0.6 M and then 1.0 M imidazole. However, this strategy has not yet been effective in recovering the protein of interest. A new assay was performed, with a total of three elution steps, using 0.3 and 0.6 M. This test showed that a recovery of 15.0% of the protein of interest and a purification factor of 3.0. Therefore, the immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) technique has been shown to be an efficient alternative in the recovery and purification of the 503 antigen from the homogenized E. coli unclarified.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufrn.br:123456789/23391 |
| Date | 08 February 2017 |
| Creators | Leit?o, Ana Laura Oliveira de S? |
| Contributors | 87510383404, http://lattes.cnpq.br/4330639792072559, Macedo, Gorete Ribeiro de, 10847022404, http://lattes.cnpq.br/3324083094904117, Bresolin, Igor Tadeu Lazzarotto, 80948588004, http://lattes.cnpq.br/5750111176589237, Sousa J?nior, Francisco Canind? de, Santos, Everaldo Silvino dos |
| Publisher | PROGRAMA DE P?S-GRADUA??O EM ENGENHARIA QU?MICA, UFRN, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFRN, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Norte, instacron:UFRN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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