Dengue fever is caused by an arbovirus of the Flaviridae family, transmitted from
person to another through an intermediate fly vector, Aedes aegypti. It is a tropical
and subtropical infectious disease characterized by fever and strong pain in joints,
which could also lead to bleeding in its hemorrhagic form. In this investigation,
Phage Display technology was used to identify recombinant peptides with affinity
to polyclonal antibodies (IgY) raised in immunized chickens with total proteins of
the DENV-3 culture. Animal sera was purified in a HiTrap column and
concentrated through dialysis. The IgY s were immunoreactive against DENV
cultures, but were not type specific. Phage clones were selected from a random
peptide library (PhD-7) in four cycles of biopanning against IgY. Selected phages
were amplified in deepwell microtiter plates and submitted to ELISA tests.
Immunoreactive clones against IgY were sequenced, translated and analysed
through bioinformatics. Fourteen distinct clones were selected and aligned against
viral proteome sequences and among themselves. Three consensus sequences
among phage clones were detected: VLRN, APP and LPP. The peptide search in
BLASTp showed similarity to the following viral proteins: polyprotein, envelop, and
the nonstructural proteins NS1, NS2a, NS3 and NS5. All of them have matched
with DENV-1, -2, -3, and/or -4 sequences, corroborating with the lack of type
specificity of the raised IgY. Considering the VLRN motif, the analyses of
antigenicity indexes of similar peptides demonstrated that its antigenicity is highly
influenced by neighboring residues. Three-dimensional analysis of the DENV-2
capsid protein, with the alignment of the VLRN motif, have identified two target
sequences, NRVSTVQQL and EIGRMLNILNRR, that are present in the
polyprotein of all four viral types, which may contain the two possible domains
VxRN and LRN, respectively. Six selected phages have presented known protein
domains, and five of them presented specific phosphorylation and glycosylation
sites, similar to known eukaryotic viruses; however, they may not be
physiologically active sites in the dengue virus. Finally, the peptides were used to
detect human IgG and IgM. ELISA tests were performed in two patients with
isolated infections of DENV-1 or DENV-3. The reactivity of the 14 clones was
superior to total antigens obtained from cultures, but they were not type specific. / RESUMO - GERAL
A dengue é uma doença infecciosa febril aguda, transmitida de uma
pessoa doente a uma pessoa sadia pela picada da fêmea contaminada de um
mosquito Aedes aegypti. A doença é causada por um arbovírus, membro da
família Flaviviridae e do gênero flavivirus. Existem quatro tipos de vírus da
dengue: Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 e Dengue 4, e há um grande espectro de
manifestações clínicas da doença, sendo as duas principais, a dengue clássica e
a dengue hemorrágica. O diagnóstico geralmente é baseado em sintomas, e
laboratorialmente é tardio, no entanto vários testes específicos para cada
sorotipo.
A tecnologia do Phage Display (exposição de biomoléculas em fagos) tem
sido amplamente utilizada no mapeamento de epítopos de diversos antígenos,
constituintes de vários agentes causadores de doenças.
Com o objetivo de selecionar peptídeos recombinantes expressos no
capsídeo de bacteriófagos produziu-se soro policlonal em galinhas previamente
sensibilizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. Após 4 ciclos de
seleção de uma biblioteca de fagos com peptídeos recombinantes lineares de 7
resíduos contra a IgY policlonal, 14 fagos imunorreativos foram selecionados e
suas seqüências de ácidos nucléicos foram posteriormente analisadas por
bioinformática. Foi possível identificar domínios protéicos comuns entre os
peptídeos, sendo que o principal domínio mapeado foi VLRN.
Testes subseqüentes se fazem necessários para a melhor caracterização
destes peptídeos, incluindo possíveis aplicações diagnósticas e vacinais dos
peptídeos selecionados.
RESUMO - CAPÍTULO I
A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviridae, transmitido de uma
pessoa à outra através de um hospedeiro intermediário, o mosquito Aedes
aegypti. É uma doença infecciosa tropical e subtropical caracterizada por febre e
dor intensa nas articulações, além de sangramentos intensos quando na sua
forma hemorrágica. Neste trabalho utilizou-se da tecnologia de exposição de
peptídeos randômicos em fagos, phage display, no intuito de identificar peptídeos
recombinantes com afinidade a anticorpos policlonais (IgY) gerados em galinhas
imunizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. As IgYs dos animais
foram purificadas em coluna HiTrap e concentradas por diálise. As IgYs foram
imunorreativas contra todas as culturas de DENV, mas não foram tipo específico.
Os clones foram selecionados de uma biblioteca de fagos randômicos (PhD-7) por
quatro ciclos de seleção contra as IgYs. Os fagos selecionados foram
amplificados em placas deepwell e submetidos a testes ELISA. Clones
imunorreativos contra IgY foram seqüenciados, traduzidos e analisados por
bioinformática. Quatorze clones distintos foram selecionados e alinhados contra a
seqüência de dados do proteoma viral e entre todos eles. Três seqüências
consenso entre os clones foram detectadas: VLRN, APP e LPP. A procura por
prováveis seqüências protéicas do vírus da dengue no BLAST mostrou
similaridade a diversos sítios protéicos virais: poliproteína, envelope e as
proteínas não-estruturais NS1, NS2a, NS3 e NS5. Todas elas se alinharam com
as seqüências dos tipos DENV-1, -2, -3, e/ou -4, corroborando com a falta de
especificidade das IgYs. Considerando o motivo VLRN, as análises dos índices de
antigenicidade dos peptídeos similares demonstraram que estes índices são
altamente influenciados pelos resíduos vizinhos. Análise 3-D da proteína do
capsídeo viral do tipo DENV-2, com superposição do motivo VLRN, identificou
duas seqüências alvos, NRVSTVQQL e EIGRMLNILNRR, que estavam presentes
na poliproteína dos quatro tipos virais, os quais podem conter dois prováveis
domínios, VxRN e LRN, respectivamente. Domínios de fosforilação e glicosilação,
encontrados em vírus eucarióticos, foram similares às seqüências presentes em
cinco fagos recombinantes selecionados, o que não implica que estes motivos
sejam fisiologicamente ativos no vírus da dengue. Finalmente, os peptídeos foram
usados para detectar IgG e IgM humana. Testes ELISA foram realizados em dois
pacientes com infecções isoladas de DENV-1 ou DENV-3. A reatividade dos 14
clones foi superior àquela observada para antígenos totais obtidos das culturas,
embora não tenha sido específica. / Mestre em Genética e Bioquímica
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_UFU:oai:repositorio.ufu.br:123456789/15837 |
| Date | 28 February 2006 |
| Creators | Santos, Paula de Souza |
| Contributors | Goulart Filho, Luiz Ricardo, Poian, Andrea Thompson da, Oliveira, Guilherme |
| Publisher | Universidade Federal de Uberlândia, Programa de Pós-graduação em Genética e Bioquímica, UFU, BR, Ciências Biológicas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFU, instname:Universidade Federal de Uberlândia, instacron:UFU |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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