Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandar@gmail.com) on 2013-06-10T19:36:18Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Gustavo Miranda.pdf: 1853807 bytes, checksum: f9a1c2b796442124414bba8e163ac719 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-10T19:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_Gustavo Miranda.pdf: 1853807 bytes, checksum: f9a1c2b796442124414bba8e163ac719 (MD5) / Doenças como a leishmaniose é uma importante causa de morbidade e mortalidade no Brasil e seus diagnósticos devem ser melhoradas. A produção de anticorpos monoclonbais anti-L. infantum e acoplamento ao sensor piezoelétrico, para formar um dispositivo bioeletrônicos capaz de detectar rapidamente antígenos de Leishmania sp, tanto qualitativa como quantitativamente, é uma alternativa promissora para o diagnóstico da leishmaniose, devido à sua alta especificidade e sensibilidade, portabilidade e baixo custo, em comparação aos métodos convencionais. Objetivo: Desenvolver um imunossensor capaz de detectar antígenos de L. infantum em tecidos de animais infectados. Material e Método: Quatro hibridomas produtores de anticorpos monoclonais anti-amastigota de L. infantum teve sua especificidade confirmada por ELISA. Esses anticorpos foram imobilizados sobre um cristal piesoelétrico de quartzo através de uma fina camada de 2-aminoetanotiol (cisteamina) e glutaraldeído, e submetidos a injeções de extratos de baço de hamster infectados e não-infectados com L. infantum. Resultados: Quatro anticorpos (5A9H8, 2B7B8, 4B6F7 e 5AB3A10B4), todos da classe IgG, foram acoplados à superfície do transdutor e foram capazes de reagir contra extrato de baço de hamster infectado com L. infantum. A metodologia desenvolvida foi capaz de detectar 3,5x10 4 amastigotas por grama de tecido infectado com os anticorpos 5A9H8, 4B6F7 e 5AB3A10B4, e 1,75x10 4 com o anticorpo 2B7B8. Conclusões: Os resultados demonstraram que este teste pode ser útil para quantificar amastigotas de L. infantum em órgãos de animais experimentais para estudos sobre a patogênese da leishmaniose visceral americana e é uma ferramenta promissora para desenvolver um diagnóstico de leismanioses humana e canina. / Salvador

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:29:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3539_1.pdf: 1868748 bytes, checksum: 2edbae82f9f846e9853b8487b972bdb6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O Toxoplasma gondii é um importante agente de uveíte posterior nos indivíduos imunocompetentes levando a perda parcial ou total da visão, caracterizando assim, a forma ocular da toxoplasmose. Atualmente, o diagnóstico laboratorial desta forma da doença, não produz bons resultados, levando a inexistência de correlação entre os níveis de anticorpos circulantes e a sintomatologia ocular, sendo comum à ocorrência de títulos baixos. Para auxiliar o diagnóstico clínico e diferenciar a lesão toxoplásmica de lesões por outra etiologia, Asai et al. (1983) produziram um anticorpo monoclonal (AcMo-2F12), contra uma enzima citosólica, a NTPase, presente na forma ativa (taquizoíto) do T. gondii. Em camundongos infectados, a detecção desta enzima na circulação, foi capaz de identificar a fase ativa do parasito. O presente estudo se propôs a testar o AcMo-2F12, em lágrimas de indivíduos com toxoplasmose ocular clinicamente ativa, como uma possível ferramenta para o diagnóstico laboratorial diferencial da uveíte posterior por T.gondii.Como ferramenta de pesquisa, utilizamos o teste de dot blot em amostras de lágrimas de 21 pacientes com uveítes posterior ativa devido a infecção pelo T. gondi (UPAPT) com lesão padrão ouro (os pacientes apresentavam lesão satélite à lesão cicatrizada) e 20 indivíduos controles sem histórico nem lesões oculares sugestivas de toxoplasmose. Discos de nitrocelulose foram incubados com as lagrimas, bloqueados e incubados durante uma hora com o AcMo 2F12 a-NTPase, seguido de incubações com conjugados a-Ig total (a-Igt) de camundongo conjugado a biotina e avidina- Peroxidase. A sensibilidade do teste foi de 95,27%, especificidade 55%, valor preditivo positivo de 63,31% e valor preditivo negativo 90,48%. Obtivemos pelo teste de Fisher um valor de p=0,0005, considerado como significante todo valor de p<0,05 e odds ratio de 21,444 (considerando I.C. de 95%: 2, 726 a 219,21). Os resultados demonstraram forte associação entre a presença de NTPase na lágrima, detectada pelo AcMo 2F12 e a toxoplasmose ocular ativa

No útero gestante dos animais com placentação do tipo hemocorial, ocorre uma migração e acúmulo transitório de linfócitos natural killer (NK) , cuja atuação na gestação não está totalmente elucidada. Estas células NK do ambiente uterino (uNK) apresentam comportamento distinto daquelas encontradas no sangue circulante (cNK), constituindo uma sub-população das células NK com expressão gênica específica ditada pelo ambiente uterino gestante. De fato, se estas células isoladas do útero de camundongos prenhes forem inoculadas em machos da mesma espécie eram capazes de induzir a resposta imunológica com produção de anticorpos que reagem especificamente com as células uNK. No presente trabalho foi utilizado um destes anticorpos monoclonais denominados de \"mouse anti-mouse uterine natural killer cell clone 1 (mam-uNK1)\" obtidos anteriormente em nosso laboratório para avaliar a especificidade deste anticorpo e a localização da molécula antigênica correspondente. Para tanto, foram utilizados cortes histológicos do útero no 9º dia de gestação, dos órgãos linfóides (baço, timo e linfonodo), do cérebro, do fígado e do coração submetidos à reações imunocitoquímicas com o anticorpo mam-uNK1 em nível da microscopia de luz e, pela imunomicroscopia eletrônica nas células uNK do útero gestante e células estriadas cardíacas do miocárdio. Foram obtidos homogenados teciduais dos mesmos órgãos avaliados pela imunocitoquímica para realização do SDS-PAGE e Western-blot com o intuído de identificar as frações protéicas reativas e homologia entre os diversos órgãos. Os padrões de imunomarcação com o mam-uNK1 foram comparadas com o padrão de reatividade da lectina DBA (Dolichos biflorus) tanto nos cortes histológicos quanto nos homogenados submetidos ao Western-blot. Os resultados demonstraram reação positiva distribuída difusamente no citoplasma, com maior intensidade no perímetro das células uNK, e marcação difusa no citoplasma das células deciduais e das células musculares lisas do miométrio. Reações positivas foram encontradas também no citoplasma das células musculares cardíacas, no citoplasma das células reticulares dos órgãos linfóides, nos feixes de nervos do sistema nervoso central e no citoplasma dos hepatócitos. Pela imunomicroscopia eletrônica foram observadas partículas de ouro coloidal em maior número no citoplasma que preenchem os prolongamentos citoplasmáticos tipo microvilosidades e no citoplasma marginal abaixo da membrana plasmática nas células uNK. Nas células musculares cardíacas as marcações mais intensas foram constatadas no citoplasma da extremidade destas células onde as miofibrilas eram menos organizadas e se ancoravam à membrana plasmática. Pelo Western-blot, foram identificadas duas bandas reativas ao mam-uNK1 com peso molecular de 52 e 54 kDa comuns a todos os órgãos analisados. Estes dados demonstram que a molécula reconhecida pelo anticorpo mam-uNK1 tem ampla distribuição em diversos tipos celulares não sendo específica para as células uNK, porém apresentam uma localização peculiar nestas células e nas células musculares cardíacas. Pelo padrão de localização identificado em imunomicroscopia eletrônica, presume-se que estas moléculas estejam associadas com a modulação do citoesqueleto nas diversas atividades que estes componentes estruturais desempenham nas células, sendo particularmente interessante a relação com a motilidade celular. / In the pregnant uterus of animals developing hemochorial type placentation occurs a transient migration and accumulation of natural killer lymphocytes (NK) which activity in the pregnancy has not been fully elucidated. These NK cells from uterine environment (uNK) present a distinct behavior from those found in the peripheral circulating blood (cNK), composing a subset of NK cells with specific gene expression that is regulated by pregnant uterus. Actually, these cells isolated from pregnant mice uteri were inoculated in the male mice of same strains, they induced immune response with production of antibodies reactivity specifically to uNK cells. In the present work it was used one of these mouse anti-mouse uterine natural killer cells clone 1 (mam-uNK1) monoclonal antibody that was obtained previously in our laboratory, in the aim to evaluate the specificity of this antibody and localization of corresponding antigenic molecule. It was used histological sections of uteri on 9º gestational day, lymphoid organs (spleen, thymus and lymph node), brain, liver and heart processed for immunocytochemistry with mam-uNK antibody at light microscopy and immunoelectron microscopy for uNK cells in pregnant uterus and cardiac muscle cells. Tissue homogenates from the same organs that were evaluated by immunocytochemistry were obtained to perform SDS-PAGE and Western-blot primary to identify the proteins fractions reactive with mam-uNK antibody and possible homology among the tissues. The immunolabeling pattern using mam-uNK both, in histological sections and Western-blot were compared with pattern of Dolichos biflorus (DBA) lectin reactions. The results showed diffuse positive reaction distributed in the cytoplasm with higher intensity on perimeter of uNK cells and diffuse labeling in the cytoplasm of decidual cells and, in smooth muscle cells of miometrium. Positive reaction was also found in the cytoplasm of cardiac muscle cells, reticular cells of lymphoid organs, hepatocytes and in the axon bundles of the brain. By immunelectron microscopy, were observed higher number of gold particles in the cytoplasm of microvillous-like cell processes and in the marginal cytoplasm near the plasma membrane of uNK cells. In the cardiac muscle cells the most conspicuous labeling was seen in the cytoplasm of muscle cells at the end portions, that is, where the myofibrills were less organized and anchoring to plasma membrane. The Western-blot identified two bands with 52 and 54 kDa reactive do mam-uNK constantly found in all organs analyzed. These data show that the molecule that is recognized by mam-uNK1 antibody is widely distributed in several cell types, not specific for mouse uNK cells, but has a very peculiar localization in these cells and in the cardiac muscle cells. To the localization pattern that was identified by immunelectron microscopy it was suggested that, these molecules were associated to the modulation of the cytoskeleton in many activities that these structural component potentially could carry out in the cells, being particularly attractive those related to cell motility.

Orientador: Valéria Marçal Félix Lima / Banca:Gisele Fabrino Machado / Banca:Sandra Helena Penha de Oliveira / Resumo: A leishmaniose é uma doença imunossupressora causada por protozoários do gênero Leishmania, tendo os cães como reservatório doméstico. A molécula Programmed Cell Death 1 (PD-1) é altamente expressa em células leucocitárias de cães com leishmaniose visceral e promove a exaustão dos linfócitos T e a supressão da secreção de citocinas. Como o PD-1 tem função supressiva em relação à imunidade celular, avaliamos o efeito de anticorpos bloqueadores de PD-1 na produção de NO, ROS, interleucina 17 (IL-17) e na carga parasitária em cultura de leucócitos esplênicos de cães naturalmente infectados. In vitro, o bloqueio de PD-1 promoveu aumento dos níveis de NO intracelular e reduziu os de IL-17 no sobrenadante da cultura, além de reduzir a carga parasitária, más não alterou os níveis de ROS. Concluímos que a PD-1 participa na regulação da resposta imune e que o anticorpo bloqueador é efetivo na restauração da atividade microbicida do hospedeiro. Isso pode ser investigado em estudos imuno-terapêuticos no futuro. / Abstract: Leishmaniasis is an immunosuppressive disease caused by protozoa of the genus Leishmania for which dogs are the domestic reservoir. The programmed cell death 1 molecule (PD-1) is highly expressed in leukocyte cells of dogs with visceral leishmaniasis, and it promotes T lymphocyte exhaustion and suppression of cytokine secretion. Because PD-1 has a suppressive function regarding cell immunity, we evaluated the effect of PD-1 blocking antibodies on NO, ROS and interleukin 17 (IL-17) production and on parasite load in spleen leukocyte cultures from naturally infected dogs. In vitro, PD-1 blocking promoted increased levels of intracellular NO and reduced the levels of IL-17 in the culture supernatant, in addition to reducing the parasite load, but do not change ROS levels. We conclude that PD-1 participates in regulation of the immune response and that the blocking antibody is effective in restoring host microbicidal activity. This can be investigated in an immuno-therapeutic study in the future. / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-06-16T14:28:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 605491 bytes, checksum: 3d6eb9f3a272ae7d5ab2a5509a143dac (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-16T14:28:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 605491 bytes, checksum: 3d6eb9f3a272ae7d5ab2a5509a143dac (MD5) Previous issue date: 2007-04-10 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / O vírus da doença infecciosa bursal (IBDV) é o agente etiológico de uma das mais importantes doenças para a indústria avícola mundial, e se caracteriza por ser altamente contagioso e produzir um estado de imunodepressão nas aves, trazendo falhas na vacinação e susceptibilidade a outras doenças, o que resulta em perdas econômicas ao setor avícola. O Brasil é o maior exportador de frango de corte do mundo o que motiva ao setor de sanidade avícola a oferecer alternativas de diagnóstico confiáveis, e rápidas, com tecnologia nacional. Por este motivo, a proposta do presente trabalho foi a produção de anticorpos monoclonais (AcM) de alta afinidade contra o vírus da doença infecciosa bursal (IBD), para uma possível utilização futura em testes de imunodiagnóstico do tipo imunofluorescência, imunohistoquímica ou ELISA de captura. Para a produção dos AcM se usou vírus inteiro proveniente de uma vacina comercial, estirpe intermediaria (Bur-706) o qual se multiplico em células VERO e foi purificado por ultracentrifugação em gradiente de sacarose, foi utilizado para a imunização dos camundongos BALB/c, usando como adjuvante saponina, o que permitiu a obtenção de anticorpos policlonais capazes de revelar a enzima por ELISA. A fusão das células esplênicas dos camundongos imunizados e o mieloma SP2/0 resultou na obtenção de 2 famílias de hibridomas (2H11 e 5C7) secretores de anticorpos. Após clonagem por diluição limitante, foram obtidos 3 clones secretores de AcM da classe IgG. Os três AcM obtidos foram capazes de revelar as proteínas virais VPX e VP2 por ”western blotting”, reconhecendo a proteína de 47 kDa e 41 kDa. A definição dos isótipos reconhecidos pelos AcM obtidos devem ser objeto de investigações futuras, de modo a permitir a utilização dos anticorpos em ensaios imunoenzimáticos para estudos epidemiológicos da doença o para diferenciar vírus vacinal e de campo. / The infectious bursal disease virus (IBDV) causes highly contagious and immunosuppressive disease for the world poultry, resulting in an impaired response to vaccination and susceptibility to other diseases, and severe economical losses to the poultry activity. Brazil is the world ́s largest exporter of chicken meat, condition which demands reliable and rapid procedures for diagnosis. The proposal of the present work is the production of monoclonal antibodies (MAbs) of high affinity against IBDV. The IBDV was strain S 706 (the intermediate vaccine) was replicated in VERO cell and purified by sucrose gradient, for ELISA and mice inoculation. For the immunization of the mice BALB/c using as a saponin adjuvant, that allowed an inflammation reaction which enhanced the antibody response, detectable by ELISA. The fusion of splenic cells of the immunized mice and the mieloma SP2/0 resulted in 2 hybridoma families (2H11 and 5C7). After cloning by limiting dilution, 3 clones secretors of MAbs from IgG class were obtained. The 3 obtained MAbs were capable to reveal the proteins turn VPX and VP2 by "western blotting", respectively of 47 kDa and 41 kDa. The definition of the isotypes recognized by obtained MAbs must be object of future characterization to allow the use of the antibodies in immunodiagnostic tests such as immunofluorescence, immunocitochemistry or capture ELISA, for epidemiologic of the disease researches or to differentiate vaccine’s virus of the field virus.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-06-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O melanoma cutaneo e um tumor originado a partir da proliferacao descontrolada de melanocitos. A incidencia do melanoma maligno tem aumentado significativamente nas ultimas decadas e se tornado um problema de saude publica em muitos paises. Na imunoterapia contra o cancer, anticorpos monoclonais (mAbs) sao utilizados como ferramentas para diagnostico, monitoramento e tratamento da doenca. A descoberta de novos alvos terapeuticos para mAbs em celulas tumorais, e a determinacao dos mecanismos de citotoxicidade gerados pelos mesmos pode ampliar significativamente as possibilidades e o sucesso dos tratamentos. Anteriormente em nosso laboratorio, Dobroff e colaboradores (2002) isolaram um mAb (mAb A4) que foi citotoxico in vitro sobre celulas de melanoma murino B16F10-Nex2 e sobre algumas celulas tumorais humanas, efeito independente do complemento, mas aumentado por este. O mAb A4 reduziu o desenvolvimento do melanoma murino B16F10-Nex2 in vivo, aumentando a sobrevida dos animais. O alvo do mAb A4 na superficie celular e a proteina Protocaderina ƒÀ13 (PCDHƒÀ13), membro da superfamilia das caderinas. A interacao entre ambos levou as celulas tumorais a morte, em processo sugestivo de apoptose (Dobroff et. al., 2010, em publicacao). Neste trabalho, verificamos a reatividade do mAb A4 com celulas do melanoma murino e com algumas outras linhagens tumorais humanas atraves de ELISAQuimioluminescente e Imunofluorescencia Indireta. A expressao do gene PcdhƒÀ13 foi verificada por RT-PCR nao quantitativo e a expressao da proteina PCDHƒÀ13, por Immunoblotting. Verificou-se que, somente celulas que expressam a proteina PCDHƒÀ13 na membrana plasmatica sao suscetiveis a acao do mAb A4. O mAb A4 foi citotoxico in vitro contra o melanoma murino e contra linhagens tumorais humanas, incluindo melanoma, carcinoma de colon, carcinoma de cervice uterino e glioblastoma. O mAb A4 nao foi citotoxico contra linhagens humanas de carcinoma de mama e contra a linhagem de melanocitos murinos imortalizados melan A, que nao expressam a PCDHƒÀ13. A interacao do mAb A4 com celulas B16F10-Nex2.1 in vitro ocasionou a endocitose do mAb A4 em vesiculas, rapida reducao nos niveis de ƒÀ-catenina livre no citoplasma e do fator de transcricao TCF-4, redistribuicao da ƒÀ-catenina para a periferia celular, ativacao das caspases-9, -3 e -6, exposicao de fosfatidilserina na membrana plasmatica, condensacao da cromatina e degradacao internucleossomal do DNA, corroborando a inducao de um processo de morte por apoptose pela via intrinseca nessa celula tumoral. Adicionalmente, observou-se o aumento da producao de especies reativas de oxigenio, que podem amplificar o processo apoptotico. A inibicao da via de sinalizacao da ƒÀ-catenina sugere que vias de sinalizacao intracelular que regulam o crescimento e a sobrevivencia foram inibidas pela interacao entre o mAb A4 e seu alvo na celula. A presenca de vesiculas sugestivas de autofagossomos nas imagens de microscopia de transmissao eletronica pode indicar a inducao de um processo de autofagia em paralelo ao processo apoptotico. Concluimos que o mAb A4 demonstrou ser um potencial agente anti-tumoral com atividade contra diversos tipos de tumores murinos e humanos. A proteina PCDHƒÀ13 pode ser um potencial marcador de malignidade para o melanoma. A interacao entre o mAb A4 e a PCDHƒÀ13 levou a celula de melanoma a morte atraves da inibicao da via de sinalizacao intracelular b-catenina/TCF-4 e da inducao de apoptose pela via intrinseca. O processo de autofagia pode ter uma possivel participacao no efeito anti-tumoral induzido pelo mAb A4. / Malignant melanoma is a highly metastatic skin cancer which arises from malignant transformation of melanocytes. Incidence of melanoma has been increasing in the last decades, becoming a major public health problem in many countries. Monoclonal antibodies (mAbs) have been used in cancer immunotherapy as tools for diagnosis, monitoring and treatment of tumors. The discovery of new therapeutic targets for mAbs in tumor cells, and the establishment of their cytotoxic mechanisms might significantly improve the possibilities and efficacy of cancer treatments. Previously in our research group, Dobroff and collaborators (2002) produced a mAb, named A4, which was cytotoxicity in vitro against B16F10-Nex2 murine melanoma cells and some human tumor cell lines. This effect was independent of complement, although enhanced by it. MAb A4 decreased B16F10-Nex2 murine melanoma development in vivo, significantly increasing animal survival. This mAb recognizes Protocadherin â13 (PCDHâ13) at tumor cell surface, a protein that belongs to the cadherin superfamily, and preliminary results suggested that mAb A4/PCDHâ13 interaction leads tumor cell to apoptosis (Dobroff et. al., 2010, in press). In the present work, mAb A4 reactivity with murine melanoma cells and several human tumor cell lines was verified by Chemoluminescent ELISA and Indirect Immunofluorescence assays. Pcdhâ13 mRNA expression was detected by nonquantitative RT-PCR and PCDHâ13 protein expression by Immunoblotting assay. Only PCDHâ13-expressing tumor cells were susceptible to mAb A4 cytotoxicity. MAb A4 was cytotoxic in vitro to murine melanoma and to human tumor cell lines, including melanoma, colon carcinoma, cervical uterine epithelioid carcinoma and glioblastoma. MAb A4 had no activity against breast carcinoma cell lines and murine immortalized melanocytes melan A, which do not express PCDHâ13. MAb A4 interaction with B16F10-Nex2.1 cells in vitro triggered mAb A4 endocytosis, rapid reduction of free cytoplasmic â-catenin and TCF-4 concentrations, redistribution of â-catenin to cell periphery, caspases-9, -3, and -6 activation, phosphatidilserine translocation to cell membrane, chromatin condensation and internucleossomal DNA fragmentation, confirming the induction of mitochondrialdependent apoptosis in that tumor cell line. Additionally, mAb A4 induced overproduction of oxygen reactive species, which can amplify the apoptotic process. The inhibition of â-catenin signaling suggests that signaling pathways that regulate cell survival and growth were inhibited by mAb A4 interaction with its target on the cell surface. Transmission electron microscopy images revealed the presence of autophagosomes, suggesting the simultaneous induction of autophagy and apoptosis by mAb A4. We conclude that mAb A4 may represent a new therapeutic agent with antitumor activity against murine and human tumors. PCDHâ13 is a potential melanoma marker. MAb A4 interaction with PCDHâ13 induced cell death through inhibition of b-catenin/TCF-4 signaling pathway and induction of the apoptosis intrinsic pathway. The autophagic process might be also implicated in mAb A4 cytotoxic effect. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Submitted by Gabriela Torres Rebech (gtr.torres@hotmail.com) on 2018-05-11T23:25:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Gabriela.pdf: 515150 bytes, checksum: 8dcf7e5ca4b514e5c7c8ada92438306b (MD5) / Approved for entry into archive by Ederson Vasconcelos Pereira null (edersonpereira@fmva.unesp.br) on 2018-05-14T17:16:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rebech_gt_me_araca_int.pdf: 515150 bytes, checksum: 8dcf7e5ca4b514e5c7c8ada92438306b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T17:16:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rebech_gt_me_araca_int.pdf: 515150 bytes, checksum: 8dcf7e5ca4b514e5c7c8ada92438306b (MD5) Previous issue date: 2018-04-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A leishmaniose é uma doença imunossupressora causada por protozoários do gênero Leishmania, tendo os cães como reservatório doméstico. A molécula Programmed Cell Death 1 (PD-1) é altamente expressa em células leucocitárias de cães com leishmaniose visceral e promove a exaustão dos linfócitos T e a supressão da secreção de citocinas. Como o PD-1 tem função supressiva em relação à imunidade celular, avaliamos o efeito de anticorpos bloqueadores de PD-1 na produção de NO, ROS, interleucina 17 (IL-17) e na carga parasitária em cultura de leucócitos esplênicos de cães naturalmente infectados. In vitro, o bloqueio de PD-1 promoveu aumento dos níveis de NO intracelular e reduziu os de IL-17 no sobrenadante da cultura, além de reduzir a carga parasitária, más não alterou os níveis de ROS. Concluímos que a PD-1 participa na regulação da resposta imune e que o anticorpo bloqueador é efetivo na restauração da atividade microbicida do hospedeiro. Isso pode ser investigado em estudos imuno-terapêuticos no futuro. / Leishmaniasis is an immunosuppressive disease caused by protozoa of the genus Leishmania for which dogs are the domestic reservoir. The programmed cell death 1 molecule (PD-1) is highly expressed in leukocyte cells of dogs with visceral leishmaniasis, and it promotes T lymphocyte exhaustion and suppression of cytokine secretion. Because PD-1 has a suppressive function regarding cell immunity, we evaluated the effect of PD-1 blocking antibodies on NO, ROS and interleukin 17 (IL-17) production and on parasite load in spleen leukocyte cultures from naturally infected dogs. In vitro, PD-1 blocking promoted increased levels of intracellular NO and reduced the levels of IL-17 in the culture supernatant, in addition to reducing the parasite load, but do not change ROS levels. We conclude that PD-1 participates in regulation of the immune response and that the blocking antibody is effective in restoring host microbicidal activity. This can be investigated in an immuno-therapeutic study in the future.

Dengue fever is caused by an arbovirus of the Flaviridae family, transmitted from person to another through an intermediate fly vector, Aedes aegypti. It is a tropical and subtropical infectious disease characterized by fever and strong pain in joints, which could also lead to bleeding in its hemorrhagic form. In this investigation, Phage Display technology was used to identify recombinant peptides with affinity to polyclonal antibodies (IgY) raised in immunized chickens with total proteins of the DENV-3 culture. Animal sera was purified in a HiTrap column and concentrated through dialysis. The IgY s were immunoreactive against DENV cultures, but were not type specific. Phage clones were selected from a random peptide library (PhD-7) in four cycles of biopanning against IgY. Selected phages were amplified in deepwell microtiter plates and submitted to ELISA tests. Immunoreactive clones against IgY were sequenced, translated and analysed through bioinformatics. Fourteen distinct clones were selected and aligned against viral proteome sequences and among themselves. Three consensus sequences among phage clones were detected: VLRN, APP and LPP. The peptide search in BLASTp showed similarity to the following viral proteins: polyprotein, envelop, and the nonstructural proteins NS1, NS2a, NS3 and NS5. All of them have matched with DENV-1, -2, -3, and/or -4 sequences, corroborating with the lack of type specificity of the raised IgY. Considering the VLRN motif, the analyses of antigenicity indexes of similar peptides demonstrated that its antigenicity is highly influenced by neighboring residues. Three-dimensional analysis of the DENV-2 capsid protein, with the alignment of the VLRN motif, have identified two target sequences, NRVSTVQQL and EIGRMLNILNRR, that are present in the polyprotein of all four viral types, which may contain the two possible domains VxRN and LRN, respectively. Six selected phages have presented known protein domains, and five of them presented specific phosphorylation and glycosylation sites, similar to known eukaryotic viruses; however, they may not be physiologically active sites in the dengue virus. Finally, the peptides were used to detect human IgG and IgM. ELISA tests were performed in two patients with isolated infections of DENV-1 or DENV-3. The reactivity of the 14 clones was superior to total antigens obtained from cultures, but they were not type specific. / RESUMO - GERAL A dengue é uma doença infecciosa febril aguda, transmitida de uma pessoa doente a uma pessoa sadia pela picada da fêmea contaminada de um mosquito Aedes aegypti. A doença é causada por um arbovírus, membro da família Flaviviridae e do gênero flavivirus. Existem quatro tipos de vírus da dengue: Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 e Dengue 4, e há um grande espectro de manifestações clínicas da doença, sendo as duas principais, a dengue clássica e a dengue hemorrágica. O diagnóstico geralmente é baseado em sintomas, e laboratorialmente é tardio, no entanto vários testes específicos para cada sorotipo. A tecnologia do Phage Display (exposição de biomoléculas em fagos) tem sido amplamente utilizada no mapeamento de epítopos de diversos antígenos, constituintes de vários agentes causadores de doenças. Com o objetivo de selecionar peptídeos recombinantes expressos no capsídeo de bacteriófagos produziu-se soro policlonal em galinhas previamente sensibilizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. Após 4 ciclos de seleção de uma biblioteca de fagos com peptídeos recombinantes lineares de 7 resíduos contra a IgY policlonal, 14 fagos imunorreativos foram selecionados e suas seqüências de ácidos nucléicos foram posteriormente analisadas por bioinformática. Foi possível identificar domínios protéicos comuns entre os peptídeos, sendo que o principal domínio mapeado foi VLRN. Testes subseqüentes se fazem necessários para a melhor caracterização destes peptídeos, incluindo possíveis aplicações diagnósticas e vacinais dos peptídeos selecionados. RESUMO - CAPÍTULO I A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviridae, transmitido de uma pessoa à outra através de um hospedeiro intermediário, o mosquito Aedes aegypti. É uma doença infecciosa tropical e subtropical caracterizada por febre e dor intensa nas articulações, além de sangramentos intensos quando na sua forma hemorrágica. Neste trabalho utilizou-se da tecnologia de exposição de peptídeos randômicos em fagos, phage display, no intuito de identificar peptídeos recombinantes com afinidade a anticorpos policlonais (IgY) gerados em galinhas imunizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. As IgYs dos animais foram purificadas em coluna HiTrap e concentradas por diálise. As IgYs foram imunorreativas contra todas as culturas de DENV, mas não foram tipo específico. Os clones foram selecionados de uma biblioteca de fagos randômicos (PhD-7) por quatro ciclos de seleção contra as IgYs. Os fagos selecionados foram amplificados em placas deepwell e submetidos a testes ELISA. Clones imunorreativos contra IgY foram seqüenciados, traduzidos e analisados por bioinformática. Quatorze clones distintos foram selecionados e alinhados contra a seqüência de dados do proteoma viral e entre todos eles. Três seqüências consenso entre os clones foram detectadas: VLRN, APP e LPP. A procura por prováveis seqüências protéicas do vírus da dengue no BLAST mostrou similaridade a diversos sítios protéicos virais: poliproteína, envelope e as proteínas não-estruturais NS1, NS2a, NS3 e NS5. Todas elas se alinharam com as seqüências dos tipos DENV-1, -2, -3, e/ou -4, corroborando com a falta de especificidade das IgYs. Considerando o motivo VLRN, as análises dos índices de antigenicidade dos peptídeos similares demonstraram que estes índices são altamente influenciados pelos resíduos vizinhos. Análise 3-D da proteína do capsídeo viral do tipo DENV-2, com superposição do motivo VLRN, identificou duas seqüências alvos, NRVSTVQQL e EIGRMLNILNRR, que estavam presentes na poliproteína dos quatro tipos virais, os quais podem conter dois prováveis domínios, VxRN e LRN, respectivamente. Domínios de fosforilação e glicosilação, encontrados em vírus eucarióticos, foram similares às seqüências presentes em cinco fagos recombinantes selecionados, o que não implica que estes motivos sejam fisiologicamente ativos no vírus da dengue. Finalmente, os peptídeos foram usados para detectar IgG e IgM humana. Testes ELISA foram realizados em dois pacientes com infecções isoladas de DENV-1 ou DENV-3. A reatividade dos 14 clones foi superior àquela observada para antígenos totais obtidos das culturas, embora não tenha sido específica. / Mestre em Genética e Bioquímica

No útero gestante dos animais com placentação do tipo hemocorial, ocorre uma migração e acúmulo transitório de linfócitos natural killer (NK) , cuja atuação na gestação não está totalmente elucidada. Estas células NK do ambiente uterino (uNK) apresentam comportamento distinto daquelas encontradas no sangue circulante (cNK), constituindo uma sub-população das células NK com expressão gênica específica ditada pelo ambiente uterino gestante. De fato, se estas células isoladas do útero de camundongos prenhes forem inoculadas em machos da mesma espécie eram capazes de induzir a resposta imunológica com produção de anticorpos que reagem especificamente com as células uNK. No presente trabalho foi utilizado um destes anticorpos monoclonais denominados de \"mouse anti-mouse uterine natural killer cell clone 1 (mam-uNK1)\" obtidos anteriormente em nosso laboratório para avaliar a especificidade deste anticorpo e a localização da molécula antigênica correspondente. Para tanto, foram utilizados cortes histológicos do útero no 9º dia de gestação, dos órgãos linfóides (baço, timo e linfonodo), do cérebro, do fígado e do coração submetidos à reações imunocitoquímicas com o anticorpo mam-uNK1 em nível da microscopia de luz e, pela imunomicroscopia eletrônica nas células uNK do útero gestante e células estriadas cardíacas do miocárdio. Foram obtidos homogenados teciduais dos mesmos órgãos avaliados pela imunocitoquímica para realização do SDS-PAGE e Western-blot com o intuído de identificar as frações protéicas reativas e homologia entre os diversos órgãos. Os padrões de imunomarcação com o mam-uNK1 foram comparadas com o padrão de reatividade da lectina DBA (Dolichos biflorus) tanto nos cortes histológicos quanto nos homogenados submetidos ao Western-blot. Os resultados demonstraram reação positiva distribuída difusamente no citoplasma, com maior intensidade no perímetro das células uNK, e marcação difusa no citoplasma das células deciduais e das células musculares lisas do miométrio. Reações positivas foram encontradas também no citoplasma das células musculares cardíacas, no citoplasma das células reticulares dos órgãos linfóides, nos feixes de nervos do sistema nervoso central e no citoplasma dos hepatócitos. Pela imunomicroscopia eletrônica foram observadas partículas de ouro coloidal em maior número no citoplasma que preenchem os prolongamentos citoplasmáticos tipo microvilosidades e no citoplasma marginal abaixo da membrana plasmática nas células uNK. Nas células musculares cardíacas as marcações mais intensas foram constatadas no citoplasma da extremidade destas células onde as miofibrilas eram menos organizadas e se ancoravam à membrana plasmática. Pelo Western-blot, foram identificadas duas bandas reativas ao mam-uNK1 com peso molecular de 52 e 54 kDa comuns a todos os órgãos analisados. Estes dados demonstram que a molécula reconhecida pelo anticorpo mam-uNK1 tem ampla distribuição em diversos tipos celulares não sendo específica para as células uNK, porém apresentam uma localização peculiar nestas células e nas células musculares cardíacas. Pelo padrão de localização identificado em imunomicroscopia eletrônica, presume-se que estas moléculas estejam associadas com a modulação do citoesqueleto nas diversas atividades que estes componentes estruturais desempenham nas células, sendo particularmente interessante a relação com a motilidade celular. / In the pregnant uterus of animals developing hemochorial type placentation occurs a transient migration and accumulation of natural killer lymphocytes (NK) which activity in the pregnancy has not been fully elucidated. These NK cells from uterine environment (uNK) present a distinct behavior from those found in the peripheral circulating blood (cNK), composing a subset of NK cells with specific gene expression that is regulated by pregnant uterus. Actually, these cells isolated from pregnant mice uteri were inoculated in the male mice of same strains, they induced immune response with production of antibodies reactivity specifically to uNK cells. In the present work it was used one of these mouse anti-mouse uterine natural killer cells clone 1 (mam-uNK1) monoclonal antibody that was obtained previously in our laboratory, in the aim to evaluate the specificity of this antibody and localization of corresponding antigenic molecule. It was used histological sections of uteri on 9º gestational day, lymphoid organs (spleen, thymus and lymph node), brain, liver and heart processed for immunocytochemistry with mam-uNK antibody at light microscopy and immunoelectron microscopy for uNK cells in pregnant uterus and cardiac muscle cells. Tissue homogenates from the same organs that were evaluated by immunocytochemistry were obtained to perform SDS-PAGE and Western-blot primary to identify the proteins fractions reactive with mam-uNK antibody and possible homology among the tissues. The immunolabeling pattern using mam-uNK both, in histological sections and Western-blot were compared with pattern of Dolichos biflorus (DBA) lectin reactions. The results showed diffuse positive reaction distributed in the cytoplasm with higher intensity on perimeter of uNK cells and diffuse labeling in the cytoplasm of decidual cells and, in smooth muscle cells of miometrium. Positive reaction was also found in the cytoplasm of cardiac muscle cells, reticular cells of lymphoid organs, hepatocytes and in the axon bundles of the brain. By immunelectron microscopy, were observed higher number of gold particles in the cytoplasm of microvillous-like cell processes and in the marginal cytoplasm near the plasma membrane of uNK cells. In the cardiac muscle cells the most conspicuous labeling was seen in the cytoplasm of muscle cells at the end portions, that is, where the myofibrills were less organized and anchoring to plasma membrane. The Western-blot identified two bands with 52 and 54 kDa reactive do mam-uNK constantly found in all organs analyzed. These data show that the molecule that is recognized by mam-uNK1 antibody is widely distributed in several cell types, not specific for mouse uNK cells, but has a very peculiar localization in these cells and in the cardiac muscle cells. To the localization pattern that was identified by immunelectron microscopy it was suggested that, these molecules were associated to the modulation of the cytoskeleton in many activities that these structural component potentially could carry out in the cells, being particularly attractive those related to cell motility.

Linfomas são doenças originárias do sistema linfático, descritos por Thomas Hodgkin em 1932. São tradicionalmente classificados em dois grupos básicos: doenças de Hodgkin e linfomas do tipo não hodgkin (LNH). Inicialmente, pacientes com LNH foram tratados com radioterapia apenas ou combinada com imunoterapia usando-se anticorpo monoclonal anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). Porém, radioimunoterapia é uma nova modalidade de tratamento para pacientes portadores de LNH, na qual radiação citotóxica proveniente de radioisótopos terapêuticos é depositada nos tumores via anticorpos monoclonais (Acms). Este estudo concentrou-se nas condições de marcação do Acm anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche), com radioiodo (131I), pelo método direto, usando-se Cloramina-T como agente oxidante. Foram estudados parâmetros de marcação tais como: método de purificação, influência de tempo de incubação, influência de massa de agente oxidante, estabilidade in vitro e in vivo, imunoreatividade do anticorpo e distribuição biológica do anticorpo marcado em camundongos Swiss sadios. Produto de alta pureza radioquímica foi obtido, sem diferença notável entre os métodos aplicados. Não foi observada nenhuma influência direta do tempo de incubação na pureza radioquímica do anticorpo marcado. Um pequeno decréscimo na pureza radioquímica foi observado quando variou-se a massa do Acm sem variar a atividade do radioiodo. Após purificação, o anticorpo marcado apresentou pureza radioquímica de aproximadamente 100 %. Observou-se um produto de alta pureza radioquímica quando o anticorpo foi marcado na condição padrão. O anticorpo anti-CD20 apresentou variações de pureza radioquímica quando sua estabilidade foi testada em cinco condições estabilizadoras diferentes. Entretanto, a condição em que ácido gentísico foi combinado com congelamento demonstrou-se apropriada e capaz de minimizar os efeitos de autoradiólise do anticorpo marcado com alta atividade terapêutica de iodo-131. O anticorpo marcado apresentou imunoreatividade abaixo da relatada na literatura. A distribuição biológica em camundongos Swiss sadios revelou captação elevada no pulmão, fígado, e intestino delgado. O clareamento sanguíneo do anticorpo marcado foi relativamente rápido. Contudo, dados experimentais revelaram que anticorpos monoclonais anti-CD20 podem ser seguramente marcados com alta atividade de iodo-131 usando o método de Cloramina-T. O uso de cromatografia em camada delgada (ITLC-SG) na avaliação de pureza radioquímica mostrou-se apropriado, eficiente, prático, além de simples e rápido. O método de purificação utilizado demonstrou-se eficiente para a separação do anticorpo marcado do iodo livre. A abordagem inédita apresentada neste estudo, no sentido de viabilizar transporte e comercialização do produto marcado, referiu-se ao estudo de estabilidade do Acm marcado. A distribuição biológica do anticorpo demonstrou-se compatível com a distribuição do anticorpo íntegro indicando ótima estabilidade relativa in vivo. Os resultados deste estudo confirmam a potencialidade do anticorpo para a radioimunoterapia de linfomas do tipo não-Hodgkin. / Lymphomas are malignancies of the lymphatic system, described by Thomas Hodgkin in 1932. Traditionally, lymphomas are classified in two basic groups: Hodgkin disease and non-Hodgkin lymphoma (NHL). Patients with NHL were earlier treated with radiotherapy alone or in combination with immunotherapy using monoclonal antibody anti-CD20 (ex., Rituximab-Mabthera, Roche). However, Radioimmunotherapy is a new modality of treatment for patients with NHL, in which cytotoxic radiation from therapeutic radioisotopes is delivered to tumors through monoclonal antibodies. This study focused on labeling conditions of monoclonal antibody anti-CD20 (Rituximab-Mabthera, Roche) with iodine-131, by direct radioiodination method using Chloramine-T as oxidizing agent. Labeling parameters investigated were: Radiochemical purity (RP), method of purification, incubation time, antibody mass, oxidative agent mass, stability in vitro, stability in vivo, immunoreactivity and biological distribution performed in normal Swiss mouse. Product of high radiochemical purity was obtained with no notable difference between the methods applied. No clear evidence of direct influence of incubation time on radiochemical purity of the labeled antibody was observed. Whereas, a clear evidence of direct influence of activity on radiochemical purity of the labeled antibody was observed when antibody mass was varied. After purification, the labeled product presented radiochemical purity of approximately 100 %. Product of superior radiochemical yield was observed when standard condition of labeling was used. The labeled product presented variation in radiochemical purity using five different stabilizer conditions. The condition in which gentisic acid was combined with freeze appears more suitable and capable of minimizing autoradiolysis of the antibody labeled with high therapeutic activity of iodine-131. The labeled product presented low immunoreactivity when compared to the literature. Biological distribution in normal Swiss mouse demonstrated high uptake of the labeled antibody in lungs, liver, and small intestine. The progressive loss of activity in blood indicates fast blood clearance of the labeled antibody that is eliminated through the kidney, in urine. The experimental data proved that mAb anti-CD20 can be securely labeled with high therapeutic activity of iodine-131 using Chloramine-T method. Radiochemical purity determined by chromatographic plates (ITLC-SG) proved to be appropriate, efficient, practical and simple. The purification method demonstrated to be appropriate and efficient for separating the labeled antibody from free iodine. The results of stability of the labeled antibody presented in this study suggest that the product can be transported and commercialized using the condition in which gentisic acid was combined with freeze. In vivo distribution of the labeled antibody shows to be compatible with integral antibody distribution, indicating good in vivo stability. Results obtained in this study confirmed the potential of the labeled product anti-CD20-131I for radioimmunotherapy of non-Hodgkin lymphoma (NHL).