Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral leishmaniasis (VL) is a serious infectious disease that if left untreated can lead to death. Chemotherapy is the main form of treatment and antimony are the drugs of first choice. Treatment efficacy is a consequence of the immunological profile of the patient, the pharmacokinetic properties of the drug and the inherent differences in each strain. The resistance of parasites to the antimonial and resistance to treatment is emerging worldwide. Few studies using clinical isolates of patients refractory to treatment seeking to understand the machinery of resistance. Thus, the present study aimed to characterize phenotypic components of clinical isolates of Leishmania (L.) infantum obtained from patients with LV refractory to treatment with Glucantime®. changes were evaluated ultrastructural front of the trivalent antimony (SbIII) and Action transport pumps related to drug efflux. In total, four strains were used: Two isolates treatment refractory patients and two isolates from patients responsive to treatment with antimony. The susceptibility of these strains was evaluated in vitro exposure to increasing concentrations of promastigotes SbIII and determination of median inhibitory concentration (IC50). In comparison, the IC50s of separate refractory patients are significantly greater than the IC50 of patients responsive isolated, showing an in vitro drug resistance profile. From these results, the concentration of 615 μM of SbIII was chosen to perform the experiments. This concentration proved to be toxic, but fully compatible with survival in all isolates. Then the isolates were subjected to transmission electron microscopy (TEM) after being exposed to 615 μM of SbIII for 48 hours. The two isolates from patients responsive to treatment demonstrated significant ultrastructural changes, with the presence of vacuolization, disorganization and cytoplasmic compression with increased eletrodensidade, and the strong presence of cells with intense loss eletrodense the cytoplasm, indicating incompatibility with life. While the two isolates from treatment refractory patients had preserved ultrastructure, with the presence of morphologically altered, compressed and electrodense cells, indicating the stress response. Finally, to assess the presence of transmembrane transport mechanisms related to drug efflux, the isolates were subjected to two protocols: using the fluorescent probe Rhodamine 123 with the channel blocker, verapamil hydrochloride, and the exposure to SbIII plus verapamil hydrochloride The results showed that MDR-1 type pumps are not related to the different in vitro resistance profiles to antimony in isolates from antimony-refractory patients. Together, the results of this study show that clinical refractory patients isolates have phenotypic characteristics that make her different behavior of isolates from patients responsive when exposed to antimony in vitro. / A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecciosa grave que se não tratada pode levar a morte. A quimioterapia é a principal forma de tratamento e os antimoniais são as drogas de primeira escolha. A eficácia do tratamento é uma consequência do perfil imunológico do paciente, das propriedades farmacocinéticas da droga e das diferenças intrínsecas de cada cepa. A resistência dos parasitos aos antimoniais e a refratariedade ao tratamento é mundialmente emergente. Poucos estudos utilizam isolados clínicos de pacientes refratários ao tratamento buscando compreender as maquinarias de resistência. Dessa forma o presente estudo teve como objetivo caracterizar componentes fenotípicos de isolados clínicos de Leishmania (L.) infantum obtidos de pacientes com LV refratários ao tratamento com Glucantime®. Foram avaliadas alterações ultraestruturais frente ao antimonial trivalente (SbIII) e ação de bombas de transporte relacionadas ao efluxo de droga. No total, foram utilizados quatro isolados: dois isolados de pacientes refratários ao tratamento e dois isolados de pacientes responsivos ao tratamento com antimonial. A susceptibilidade desses isolados foi avaliada in vitro com a exposição de promastigotas a concentrações crescentes de SbIII e determinação da concentração inibitória média (IC50). Quando comparadas, as IC50s dos isolados de pacientes refratários são significativamente maiores que as IC50s dos isolados de pacientes responsivos, mostrando um perfil de resistência a droga in vitro. A partir desses resultados, a concentração de 615 μM de SbIII foi escolhida para a execução dos experimentos. Essa concentração demonstrou ser tóxica, mas compatível com a sobrevivência em todos os isolados. Em seguida, os isolados foram submetidos a microscopia eletrônica de transmissão (MET) após serem expostos a 615 μM de SbIII por 48h. Os dois isolados de pacientes responsivos ao tratamento demonstraram alterações ultraestruturais significativas, com a presença de vacuolização, desorganização e compactação citoplasmática, com aumento da eletrodensidade, e a presença marcante de células com intensa perda de conteúdo eletrodenso do citoplasma, indicando incompatibilidade com a vida. Enquanto os dois isolados obtidos de pacientes refratários ao tratamento apresentaram algumas células morfologicamente alteradas, compactadas e eletrodensas, indicando resposta ao estresse. Por fim, para avaliar a presença de mecanismos de transporte transmembrana relacionados ao efluxo de droga, os isolados foram submetidos a dois protocolos: o uso da sonda fluorescente Rodamina 123 junto ao bloqueador de canais, cloridrato de verapamil, além do uso direto do verapamil na reversão da resistência durante a exposição ao SbIII in vitro. Os resultados obtidos demonstraram que bombas do tipo MDR-1 não estão relacionados aos diferentes perfis de resistência in vitro ao antimonial nos isolados de pacientes refratários. Juntos, os resultados encontrados no presente trabalho demonstram que isolados clínicos de pacientes refratários possuem características fenotípicas que tornam seu comportamento diferenciado dos isolados de pacientes responsivos quando expostos ao antimonial in vitro. / São Cristóvão, SE
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:ri.ufs.br:riufs/9806 |
| Date | 02 March 2016 |
| Creators | Magalhães, Lucas Sousa |
| Contributors | Moura, Tatiana Rodrigues de |
| Publisher | Pós-Graduação em Biologia Parasitária, Universidade Federal de Sergipe |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFS, instname:Universidade Federal de Sergipe, instacron:UFS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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