O acesso à permeabilidade é uma etapa crucial na definição da via de administração de um fármaco, além de ser um dos parâmetros utilizados para a avaliação e seleção de moléculas durante as fases iniciais da pesquisa por novos fármacos. Diversos modelos in vitro têm sido descritos para a realização dos estudos de permeabilidade, mas ainda é evidente a carência de padronização de seus protocolos. O modelo de Permeabilidade em Membrana Artificial Paralela (PAMPA) é rápido e simples, podendo ser facilmente incorporado à rotina de um laboratório. Não obstante, tem apresentado excelente correlação com modelos in vitro quando na avaliação da permeabilidade de fármacos transportados pela via passiva transcelular. O principal objetivo deste trabalho foi investigar a influência das principais variáveis do método de PAMPA e seu impacto na permeabilidade de fármacos. Para tanto, foram selecionados 9 fármacos com características físico-químicas distintas, em função dos seguintes critérios: lipofilicidade (logP); Área de Superfície Polar (PSA); Volume Molecular (VM); pKa; Peso Molecular (PM); Número doadores de ligação de hidrogênio (HBD) e Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB). Os fármacos selecionados foram listados quanto à sua permeabilidade em jejuno humano (Peff) e em cultura de células Caco-2, além de Fração de Absorção (FA%) em humanos. Para o estudo das variáveis da técnica de PAMPA, a ferramenta de Desenho de Experimentos (DOE) foi utilizada e as seguintes condições de ensaio foram exploradas: gradiente de pH do meio do compartimento doador, presença ou ausência de ácido glicocólico no meio do compartimento receptor, variação do tempo de incubação, presença ou ausência de agitação das placas durante a incubação e variação da composição lipídica da membrana artificial. A combinação fatorial completa das condições de ensaio a serem exploradas resultou em 96 experimentos, os quais foram executados em triplicata. Os resultados obtidos apontaram que as variações do pH do meio do compartimento doador, do tempo de incubação e da composição do meio do compartimento receptor foram as condições do ensaio de PAMPA que mais impactaram a permeabilidade dos fármacos. Os resultados obtidos nos 96 experimentos do DOE foram relacionados, a partir de regressão linear, com os parâmetros fisico-químicos e dados de permeabilidade dos fármacos do estudo. O experimento de DOE que apresentou melhor correlação com os dados de permeabilidade em jejuno humano para os fármacos contemplados neste estudo teve um R2=0,858. As condições de ensaio consideradas para este experimento foram: pH 4,5 no compartimento doador, incubação de 15 horas, ausência de agitação das placas, membrana composta por fosfatidilcolina 10% (p/v) e colesterol 0,5% (p/v) e presença de ácido glicocólico 0,5% (p/v) no compartimento receptor. Dentre as propriedades físico-químicas, o PM, PSA e VM foram propriedades comuns a grupos de fármacos cuja permeabilidade foi favorecida pelas mesmas condições de ensaio de PAMPA. Os maiores valores de permeabilidade em PAMPA foram obtidos para fármacos com Peff entre 1 e 2 *10-4 cm/s, permeabilidade em células Caco-2 entre 20 e 27 *10-6 cm/s, faixa de logP entre 0 e 3 além de PM abaixo de 300 Da e PSA abaixo de 90Å2. / The permeability access is a critical step when defining the route of administration of a drug, besides from being one of the parameters considered for selecting the best candidates during the initial stages of new molecules discovery. For this reason, there is a need to implement high capacity and low cost models, which have a high correlation with in vivo permeability. Several in vitro models have been described for the studies of permeability, but the lack of standardization of protocols is still evident. Parallel Artificial Membrane Permeability Assay (PAMPA) is fast and simple and can be easily incorporated into the routine of a laboratory. Nevertheless, it has shown excellent correlation with in vitro models when evaluating the permeability of drugs that are transported primarily by passive transcellular route. The aim of this project was to investigate the influence of key variables of PAMPA on the permeability of drugs. Therefore, nine drugs with different physicochemical characteristics were selected based on the following criteria: lipophilicity (logP), Polar Surface Area (PSA), Molecular Volume (MV), pKa, Molecular Weight (MW), number of Hydrogen Bond Donors (HBD) and Biopharmaceutical Classification System (BCS). In addition, the drugs were listed for their permeability in human jejunum, Caco-2 and Fraction of Absorption (FA%) in humans. Design of Experiments (DOE) was considered to plan the PAMPA experiments, and the following assay conditions were explored: pH gradient in the donor compartment, glycocholic acid presence or absence in the acceptor compartment, variations in the incubation time, presence or absence of plate agitation and variations in the lipid composition of the artificial membranes. Full factorial combination of the assay variables resulted in 96 experiments, which were performed in triplicate. The results showed that the pH of the donor compartment, the incubation time and acceptor compartment composition were the assay conditions which most impacted the PAMPA results of drugs. The 96 DOE experiments results were then correlated, by linear regression, with both the physic-chemical and permeability data of the selected drugs. The DOE experiment that showed the best correlation with the permeability in human jejunum (R2 = 0.858) for the drugs included in this study had the following test conditions: pH 4.0 in the donor compartment, incubation of 15 hours, without plate agitation, artificial membrane composed of phosphatidylcholine 10% (w/v) and cholesterol 0.5% (w/v) in dodecane and presence of glycocholic acid 0.5% (w/v) in the receptor compartment. Among the studied physicochemical properties, the molecular weight (MW), polar surface area (PSA) and molecular volume (VM) were the best drivers for determining PAMPA most suitable assay conditions. The highest PAMPA values were obtained for drugs with Peff between 1 and 2 *10-4 cm/s and Caco-2 permeability between 20 and 27 *10-6 cm/s, besides from logP between 0 and 3, MW below 300 Da and PSA below 90Å2.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11062013-160147 |
| Date | 12 April 2013 |
| Creators | Reis, Juliana Mazza |
| Contributors | Serra, Cristina Helena dos Reis |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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