A hemorragia gerada por metaloproteinases de venenos de serpentes é um fenômeno complexo que resulta na ruptura de capilares e extravasamento de sangue. O HF3 (fator hemorrágico 3) é uma metaloproteinase da classe P-IIIa, extremamente hemorrágica, isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca. Análises de sua atividade proteolítica sobre proteínas isoladas mostraram que componentes do plasma e da matriz extracelular são hidrolisados pelo HF3. Estudos que utilizaram abordagens proteômicas para analisar os efeitos do HF3 na derme e plasma de camundongos evidenciaram novos alvos desta metaloproteinase, incluindo proteínas intracelulares, extracelulares e plasmáticas. Entretanto, os mecanismos envolvidos na alta atividade hemorrágica apresentada pelo HF3, principalmente no que se diz respeito ao papel da clivagem de proteínas plasmáticas no contexto da hemorragia, ainda não são conhecidos. Assim, o objetivo principal deste estudo foi analisar o degradoma do HF3 no plasma humano. Paralelamente, também realizamos a análise da atividade do HF3 sobre as proteínas do plasma da B. jararaca. Para tanto, abordagens para a depleção das proteínas mais abundantes e enriquecimento de proteínas pouco abundantes do plasma humano foram utilizadas visando minimizar o intervalo de concentração dinâmica de proteínas, e assim permitir a avaliação da atividade proteolítica do HF3 sobre um amplo espectro de proteínas, e possibilitar a detecção dos produtos de degradação por espectrometria de massas. Dessa forma, quatro amostras de plasma humano foram utilizadas neste estudo: plasma total, plasma depletado de albumina, plasma depletado das 20 proteínas mais abundantes e plasma enriquecido de proteínas pouco abundantes. A incubação das amostras de plasma humano com o HF3 foi realizada na proporção enzima:substrato 1:100 (p/p), por 2 h a 37°C. Decorrido o tempo de incubação, as frações peptídica e proteica foram analisadas. A identificação dos peptídeos presentes na fração peptídica do plasma, por espectrometria de massas, revelou os produtos oriundos da hidrólise de proteínas pelo HF3, e permitiu a análise dos pontos de clivagem. O efeito do HF3 sobre o plasma enriquecido de proteínas pouco abundantes também foi analisado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida, seguida de digestão de proteínas in gel com tripsina, e identificação das proteínas presentes em bandas diferenciais, por espectrometria de massas. Considerando todas as abordagens utilizadas neste estudo, 62 proteínas plasmáticas foram identificadas como tendo sido clivadas pelo HF3. Algumas destas proteínas corroboram estudos anteriores e outras são consideradas como candidatas a substrato desta metaloproteinase. Dentre os novos alvos, destacam-se proteínas da cascata da coagulação sanguínea e do sistema complemento, além de inibidores de proteinases, sugerindo que esta metaloproteinase pode agir de maneira desregulada, não sendo inibida pelos inibidores plasmáticos, e causando o desequilíbrio da hemostasia. A atividade do HF3 sobre as proteínas do plasma da B. jararaca foi verificada pela sua incubação com o plasma total, resultando na geração de poucos peptídeos que, no entanto, não resultaram em identificação de substratos da metaloproteinase por espectrometria de massas. Em conjunto, nossos dados reforçam achados prévios sobre o repertório de substratos do HF3 no plasma humano, apontam novos substratos e fornecem pistas para a compreensão da atividade hemorrágica do HF3 / Hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases is a complex phenomenon resulting in capillary disruption and blood extravasation. HF3 (hemorrhagic factor 3) is an extremely hemorrhagic, P-IIIa class metalloproteinase, isolated from the venom of Bothrops jararaca. The analysis of its proteolytic activity on isolated proteins showed that plasma and extracellular matrix proteins are hydrolyzed by HF3. Studies using proteomic approaches to analyze the effects of HF3 in the mouse skin and plasma showed new targets of this metalloproteinase, including intracellular, extracellular and plasma proteins. However, the mechanisms involved in the hemorrhagic process generated by HF3, particularly the role of the cleavage of plasma proteins in the context of the hemorrhage, remain not fully understood. Thus, the main objective of this study was to analyze the degradome of HF3 in human plasma. In parallel, we also carried out the analysis of the activity of HF3 on B. jararaca plasma. For this purpose, approaches for the depletion of the most abundant proteins and for the enrichment of low abundant proteins of the human plasma were used to minimize the dynamic range of protein concentration, in order to assess the proteolytic activity HF3 on a wide spectrum of proteins, and to detect the degradation products by mass spectrometry. Thus, four samples of human plasma were used in this study: whole plasma, albumin-depleted plasma, plasma depleted of the 20 most abundant proteins, and plasma enriched of low abundance proteins. Incubation of these samples with HF3 was carried out at a 1:100 (w/w) enzyme-to-substrate ratio, for 2 h, at 37°C. After the incubation time, the protein and peptide fractions were analyzed. The identification of peptides present in the plasma peptide fraction by mass spectrometry revealed the products from the hydrolysis of proteins by HF3 and allowed the analysis of the cleavage sites. The effect of HF3 on the sample of plasma enriched of low-abundance proteins was also analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by in gel protein digestion with trypsin of differential bands and identification by mass spectrometry. Considering all the approaches used in this study, 62 plasma proteins were identified as cleaved by HF3. Some of these proteins corroborate previous studies and others are considered as substrate candidates of HF3. Among the new targets, there are proteins of the coagulation cascade and of the complement system, as well as plasma proteinase inhibitors, suggesting that this metalloproteinase escapes inhibition and may act in an unregulated fashion causing the imbalance of hemostasis. The activity of HF3 on B. jararaca plasma proteins was analyzed by its incubation with whole plasma, as described above, and resulted in the generation of a low number of peptides, which, however, did not result in the identification of any substrate by mass spectrometry. Taken together, our data confirm previous findings on the repertoire of substrates of HF3 in the human plasma and suggest new substrate candidates that may contribute to the understanding of the hemorrhagic effect of HF3.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-20012015-083705 |
| Date | 22 October 2014 |
| Creators | Luciana Bertholim Nasciben |
| Contributors | Solange Maria de Toledo Serrano, Maria Teresa Machini, Ana Maria Moura da Silva |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Bioquímica), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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