Una de las características de la célula bacteriana es la capacidad de adaptarse a los cambios ambientales del entorno en el que se desarrolla modificando el patrón de expresión génica. Uno de los ejemplos mejor caracterizados es la respuesta frente al cambio de osmolaridad del medio, pero la mayoría de trabajos se han centrado en el estudio de genes cuya expresión se induce a elevada osmolaridad. Mediante mutagénesis al azar con el transposón MudJ se diseñó una estrategia para identificar genes en Salmonella enterica serovar Typhimurium cuya expresión se viera reducida a elevada osmolaridad. Siguiendo esta estrategia se identificó el gen yfeR, que codifica para una proteína, YfeR, descrita en los bancos de datos como un hipotético regulador de la familia LysR de reguladores transcripcionales. Los miembros de esta familia son generalmente proteínas activadoras de la transcripción y se encuentran en muchos géneros procariotas, regulando genes u operones que codifican funciones extremadamente diversas. En base a la regulación por osmolaridad del gen yfeR, y a la posibilidad de pertenecer a la familia LysR, se planteó como objetivo de esta Tesis Doctoral estudiar el modelo de regulación de YfeR.El análisis de secuencia de la proteína YfeR reveló características distintivas de los reguladores transcripcionales LysR: un extremo N-terminal altamente conservado con un dominio "helix-turn-helix" de unión al ADN; una cadena aminoacídica de 308 residuos (proteínas LysR tienen 300 +/- 20 AAs); una relación Lys/Arg anómala; además de la homología tanto con reguladores de la familia descritos como tal como con hipotéticos reguladores LysR. Al proporcionar el producto del gen yfeR en trans su expresión se autorregula negativamente, capacidad que presentan la mayoría de reguladores LysR. En la región promotora del gen yfeR se localizó una secuencia de unión de las proteínas LysR, T-N11-A, con la T y la A formando parte de una región invertida. Mediante ensayos de retardo en gel se demostró la capacidad de unión de la proteína YfeR a esta región, y por lo tanto al ADN. Todos estos resultados definen a YfeR como un miembro de la familia LysR.Los resultados de la regulación de la expresión del gen yfeR muestran tanto de forma indirecta, mediante una fusión génica yfeR::lacZ (MudJ), como de forma directa mediante el ensayo de protección frente a la RNasa-ONE, que el genyfeRestá osmoregulado reprimiéndose a elevada osmolaridad. A 89 pb del inicio de traducción del gen yfeR se localizó una pauta abierta de lectura, denominada yfeH, que se transcribía de forma divergente, característica compartida entre muchos reguladores de la familia LysR y sus genes regulados. Así, se planteó como hipótesis de trabajo que éste era el gen regulado por YfeR. Sin embargo, el estudio de la regulación de la expresión del gen yfeH demuestra que ésta se induce en fase estacionaria, pero de forma independiente a la presencia o ausencia de su posible regulador YfeR y de su regulación por osmolaridad. En base a este resultado se planteó la posibilidad de que la proteína YfeR regulase la expresión de otros genes alternativos al adyacente. El análisis de extractos celulares de un mutante yfeR respecto a la cepa salvaje mediante geles 2D demostró la presencia de diferentes proteínas con expresión diferencial. Dos de ellas pudieron ser identificadas por MALDI-TOF: IbpA, implicada en la protección frente a un estrés por superóxidos, y Lrp, un regulador global implicado en la modulación de una gran variedad de funciones metabólicas, así como de genes que se inducen en fase estacionaria y en respuesta a cambios ambientales. Este resultado posiciona a YfeR como una proteína LysR implicada en una red de regulación global frente a estímulos ambientales. / Bacteria adapt to changes in their environment by modifying its pattern of gene expression. Adaptation to the medium osmolarity is one of the best characterized examples, however many of the well-known situations correspond to genes whose expression is induced when medium osmolarity increases. Previous work identified by random mutagenesis in Salmonella enterica serovar Typhimurium gene yfeR, a hypothetical LysR-like regulator repressed at high osmolarity. This work is focused on the study of the model of regulation of YfeR.The sequence analysis of YfeR protein showed most of the common features of LysR family: an N-terminal conserved domain, 308 amino acids long, an anomalous Lys/Arg ratio, and homology with members of the LysR family. As for the majority of LysR regulators, YfeR negatively autoregulated its own transcription. In the promoter region of yfeR was located a sequence having characteristics of a LysR-type target consensus motif. Gel retardation assays demonstrated that YfeR binds specifically to this region. All these results clearly related YfeR to the LysR family of transcriptional regulators. About the osmoregulation of yfeR gene expression we confirmed, by indirect and direct methods (transcriptional fusion yfer::lacZ and RNasa protection assays, respectively), that its expression is repressed at high osmolarity.An ORF, yfeH, was found oriented in the opposite direction to yfeR, a common property of genes regulated by members of the LysR family. However, expression of yfeH gene is induced in stationary phase independently of the presence of YfeR and osmolarity conditions. Then we decided to search for other possible regulated genes by YfeR but not in adjacent position. Protein extracts of an yfeRmutant and wild type strains were analyzed by 2D electrophoresis. Some differences were found and two of them were identified as IbpA and Lrp. These results suggest that YfeR could be implied in a global regulation network related to environmental stimuli.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UB/oai:www.tdx.cat:10803/2397 |
| Date | 08 April 2005 |
| Creators | Baños Molina, Rosa Carmen |
| Contributors | Martínez Martínez, Josefina, Juárez Giménez, Antonio, Universitat de Barcelona. Departament de Microbiologia |
| Publisher | Universitat de Barcelona |
| Source Sets | Universitat de Barcelona |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
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