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Previous issue date: 2015-05-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Despite advances in research oncology field, has been an increased incidence and
mortality caused by cancer, consisting in a major public health problem. Literature
reports, that Morita-Baylis Hillman adducts (MBHA) show promising biological
activities, such as: antiparasitic, against Leishmania, Plasmodium sp. and
Trypanosomes, as well as effect on sea urchin embryo development. To assess
anticancer and anti-inflammatory potential of three AMBH: A2CN, and A3CN, A4CN,
we used various biological models. In MTT assay, the adducts were potentially toxic
to eight cancer cell lines tested (HL-60, MOLT-4, K562, K562-Lucena, MCF-7, HT-
29, L929 and B16F10), however A2CN was the most cytotoxic, with IC50 lower for
most cells. Acute myeloid leukemia cells, HL-60 and MOLT-4, were more sensitive
and A2CN had IC50 22 and 21 μM in these cells. In chronic myelogenic leukemia
cells, K562 and Lucena, A2CN presented IC50 of 58 and 60 μM, respectively. A2CN
has been less cytotoxic to normal cells in peripheral blood and normal human
fibroblasts (FN1), and IC50 was 78 and 126 μM, respectively. The action mechanism
induced by A2CN in K562 cells was studied at 15, 30 and 60 μM. The cell viability
has not altered when analyzed with propidium iodide, using flow cytometry, showing
that A2CN not induced necrosis in these cells. A2CN increased mitochondrial
membrane depolarization by 20 % at highest concentration tested. Cytotoxicity of
A2CN in K562 cells were related to cell cycle arrest in G1-phase at 15 μM, and Sphase
at highest concentration (60 uM) and ROS production increased at the highest
concentration tested. Cell cycle arrest in S-phase was related to high expression
mRNA of p21, p27 and p53, together with decreased expression of cyclin D1. A2CN
also augmented expression of Kv1.3 and Kv3.1 genes in K562 cells treated with 60
μM. In electrophysiological assays, using the whole-cell "patch clamp", A2CN (120
μM) promoted increase total K+ current in K562, and conductance K+ ion was
elevated. The potassium channel blocker, 4-aminopyridine (4-AP) (1 mM) decreased
the A2CN cytotoxicity in K562 cells analyzed by MTT reduction, indicating that K+
channels have been involved in its cytotoxicity. The in vitro anti-inflammatory activity
of A2CN, A3CN and A4CN was evaluated in LPS-stimulated RAW 264.7
macrophages. AMBHs did not reduced cell viability to concentration 20 μM, however,
inhibited NO and ROS production induced by LPS. IL-1 β and IL-6 production was
completely inhibited by 10 μM of AMBH, but no change in TNF-α levels. Expression
of IL-1β and IL-6 genes were also altered by A2CN, A3CN and A4CN, but only A2CN
was able to inhibit gene expression of cyclooxygenase-2 (COX-2). Therefore, it can
be concluded that A2CN showed be potent anticancer activity, acting on molecular
targets that are objects preclinical and clinical studies in oncology, such as p53, p21,
p27 and cyclin D1, and proved to be a potent activator of potassium channels.
Furthermore, adducts showed remarkable anti-inflammatory potential, a reduction of
proinflammatory cytokines such as IL-1 β and IL-6 and COX-2 expression by A2CN. / Apesar dos avanços das pesquisas no campo da oncologia, existe um aumento na
incidência do câncer e na mortalidade por esta doença, consistindo em um dos
principais problemas de saúde pública. A literatura relata que os Adutos de Morita
Baylis-Hillman (AMBH) apresentam atividades biológicas promissoras, tais como:
antiparasitária, contra Leishmania sp., Plasmodium sp., e Trypanosoma cruzi, bem
como, efeito no desenvolvimento de células embrionárias de ouriço-do-mar. Para
avaliar o potencial anticâncer e anti-inflamatório de três AMBH: A2CN, A3CN e
A4CN, utilizou-se vários modelos biológicos. Os resultados mostraram que no teste
de redução do MTT, os adutos foram potencialmente citotóxicos para as oito
linhagens cancerígenas testadas (HL-60, MOLT-4, K562, K562-Lucena, MCF-7, HT-
29, L929, B16F10), contudo A2CN foi o AMBH mais citotóxico, apresentando menor
CI50 para a maioria das linhagens. As linhagens de leucemia mielóide aguda HL-60 e
MOLT-4 foram as mais sensíveis, e A2CN apresentou CI50 de 22 e 21 μM nestas
células. Nas células de leucemia mielóide crônica K562 e Lucena, A2CN apresentou
CI50 de 58 e 60 μM, respectivamente. A2CN foi menos citotóxico para as células
normais do sangue periférico e para a linhagem de fibroblastos humano normal
(FN1), cuja CI50 foi de 78 e 126 μM, respectivamente. O mecanismo de ação de
A2CN foi estudado nas células K562, nas concentrações de 15, 30 e 60 μM. A
viabilidade da membrana celular não foi alterada, quando analisada com iodeto de
propídeo em citômetro de fluxo, mostrando que, a molécula não induziu necrose
nestas células. A2CN promoveu um aumento da despolarização da membrana
mitocondrial em 20 %, na maior concentração testada, caracterizando um
envolvimento da via intrínseca da apoptose. A atividade citotóxica de A2CN em
K562 está relacionada à parada no ciclo celular na fase G1, a partir de 15 μM, e na
fase S na maior concentração testada de 60 μM. A produção de ROS foi aumentada
na maior concentração testada. A parada no ciclo celular na fase S está relacionada
com o aumento na expressão do RNAm de p21, p27 e p53 e diminuição na
expressão de ciclina D1. A expressão dos genes para Kv1.3 e Kv3.1 também foi
aumentada nas células K562, tratadas com 60 μM. Nos ensaios eletrofisiológicos
usando a técnica de whole-cell, “patch clamp”, A2CN (120 μM) promoveu um
aumento na corrente total de K+ em K562, bem como, aumentou a condutância ao
íon K+. O bloqueador de canal de potássio, 4-aminopiridina (4-AP) (1 mM) reduziu a
citotoxicidade de A2CN nas células K562, analisadas pela redução do MTT,
indicando que os canais de K+ estão envolvidos na citotoxicidade desta molécula. A
atividade anti-inflamatória de A2CN, A3CN e A4CN, foi avaliada in vitro na linhagem
de macrófagos Raw 264.7, estimulada com (1 μg/ml) de LPS. Os AMBH não
reduziram a viabilidade das células até a concentração de 20 μM, contudo inibiram a
produção de NO e a produção de ROS induzida pelo LPS a partir da menor
concentração dos AMBH, de 2,5 μM. A produção das citocinas IL-1 e IL-6 foi
completamente inibida por 10 μM dos AMBH, mas não houve alteração nos níveis
de TNF-α. A expressão nos genes das citocinas IL-1 e IL-6, também foram alteradas
por A2CN, A3CN e A4CN, porém, apenas A2CN foi capaz de inibir a expressão do
gene da Ciclo-oxigenase-2 (COX-2). Isto posto, pode-se concluir que A2CN
apresentou potente atividade anticâncer, atuando em alvos moleculares que são
objetos de estudos pré-clínicos e clínicos na área oncológica, como p53, p21, p27 e
ciclina D1, bem como demonstrou ser um potente ativador de canais de potássio.
Além disso, os adutos apresentaram notável potencial anti-inflamatório, com
diminuição de citocinas pró-inflamatórias como IL-1 e IL-6, e inibição da expressão
de COX-2 por A2CN.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.biblioteca.ufpb.br:tede/8587 |
| Date | 29 May 2015 |
| Creators | Martins, Glaucia Verissímo Foheina |
| Contributors | Araújo, Demetrius Antonio Machado de |
| Publisher | Universidade Federal da Paraíba, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, UFPB, Brasil, Biotecnologia |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFPB, instname:Universidade Federal da Paraíba, instacron:UFPB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 32215883775770440, 600, 600, 600, 600, 1239993683399922716, -3439178843068202161, -2555911436985713659 |
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