Dermatofitoses são comumente causadas por fungos que parasitam pele e unha de humanos, cuja propagação depende do contato entre os hospedeiros infectados e não infectados. Muitos fatores contribuem para a patogenicidade dos dermatófitos, dentre eles, a capacidade de se instalar no ambiente ácido da pele se reveste de importância. Sendo assim, para ser bem sucedido, o dermatófito precisa ter capacidade aderente, germinação e penetração rápida das hifas e, portanto, dispor de uma maquinaria metabólica que atue de forma eficiente em pH ácido. A fim de identificar genes supostamente expressos nos passos iniciais da infecção, submetemos a linhagem H6 do dermatófito T. rubrum ao pH ácido por 30 minutos e 1 hora e isolamos dessas condições experimentais os transcritos com elevada expressão, empregando a metodologia de Biblioteca Subtrativa Supressiva (SSH). Obtivemos um total de 234 unigenes cujos transcritos revelaram ampla diversidade funcional. Esses transcritos estão envolvidos em 13 processos celulares diferentes, tais como, metabolismo, defesa e virulência, síntese de proteínas e transporte celular. Desses, confirmamos por Northern blotting, os genes que expressam as proteínas carboxipeptidase S1, acetoamidase, aconitase, dessaturase, a proteína TINA, transportador de aminoácidos, fator de alongamento alfa 1, proteína ribossomal L10, e uma proteína hipotética. Nesses experimentos também foi utilizada a linhagem de T. rubrum pacC-1, que tem o seu gene pacC rompido, com o objetivo de verificar se estes genes isolados seriam regulados pela proteína PacC. O gene pacC codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional PacC/Rim101p da conservada via de sinalização do pH. Verificamos que o gene pacC se expressa preferencialmente em pH 8.0 e que embora o padrão de processamento da proteína PacC seja dependente do pH a forma íntegra da proteína PacC foi identificada tanto em pH ácido como alcalino. Por outro lado, o mutante pacC-1 apresentou diminuida capacidade infectiva em fragmentos de unha humana quando comparado com a linhagem selvagem. Além disto, a atividade queratínolitica do mutante também se mostrou diminuída quando comparada ao controle, confirmando o papel da proteína PacC na capacidade infectiva do T. rubrum. / Dermatophytosis is commonly caused by fungi that parasite human skin and nail, whose propagation depends on the contact between infected and noninfected hosts. Many factors contribute to the pathogenicity of the dermatophytes. Among them, the capacity to install in the skin´s acid ambient bears great importance. Thus, in order to be successful, the dermatophyte needs to have adhering capacity, fast germination and penetration of hyphae and, therefore, needs to afford a metabolic machinery which acts efficiently in acid pH. In order to identify genes supposedly expressed in the initial steps of infection, we submitted the strain H6 of the dermatophyte T. rubrum to the acid pH for 30 minutes and 1 hour and isolated, from this experimental conditions, the transcripts with high expression, employing the suppression subtractive hybridization (SSH). We obtained a total of 234 unigenes whose transcripts revealed a wide functional diversity. These transcripts are involved in 13 different cell processes, such as metabolism, defense and virulence, protein synthesis and cell transport. Among these, we confirmed through Northern blotting the genes which express the proteins carboxipeptidase S1, acetamidase, aconitase, fatty acid desaturase, NIMA interactive protein (TINA), amino acid permease, elongation factor 1-alpha, 60S ribosomal protein L10 and a hypothetical protein. In these experiments, we also used the T. rubrum pacC- 1 strain, which has its pacC gene disrupted, aiming at verifying whether these isolated genes would be regulated by the PacC protein. The pacC gene encodes a protein homologous to the PacC/Rim101p transcriptional regulator of the conserved route of pH signaling. We verified that the pacC gene is expressed preferentially in both pH, and that although the processing pattern of the PacC protein is dependent on the pH, the full form of the PacC was identified as alkaline. On the other hand, the pacC-1 mutant presented diminished infecting capacity in human nail fragments when compared to the wild strain. Moreover, the keratinolytic activity of the mutant also seemed diminished when compared to the control, confirming the role of the PacC protein in the infecting capacity of T. rubrum.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-27052011-094600 |
| Date | 14 September 2007 |
| Creators | Silveira, Henrique Cesar Santejo |
| Contributors | Rossi, Nilce Maria Martinez |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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