Dermatofitoses são comumente causadas por fungos que parasitam pele e unha de humanos, cuja propagação depende do contato entre os hospedeiros infectados e não infectados. Muitos fatores contribuem para a patogenicidade dos dermatófitos, dentre eles, a capacidade de se instalar no ambiente ácido da pele se reveste de importância. Sendo assim, para ser bem sucedido, o dermatófito precisa ter capacidade aderente, germinação e penetração rápida das hifas e, portanto, dispor de uma maquinaria metabólica que atue de forma eficiente em pH ácido. A fim de identificar genes supostamente expressos nos passos iniciais da infecção, submetemos a linhagem H6 do dermatófito T. rubrum ao pH ácido por 30 minutos e 1 hora e isolamos dessas condições experimentais os transcritos com elevada expressão, empregando a metodologia de Biblioteca Subtrativa Supressiva (SSH). Obtivemos um total de 234 unigenes cujos transcritos revelaram ampla diversidade funcional. Esses transcritos estão envolvidos em 13 processos celulares diferentes, tais como, metabolismo, defesa e virulência, síntese de proteínas e transporte celular. Desses, confirmamos por Northern blotting, os genes que expressam as proteínas carboxipeptidase S1, acetoamidase, aconitase, dessaturase, a proteína TINA, transportador de aminoácidos, fator de alongamento alfa 1, proteína ribossomal L10, e uma proteína hipotética. Nesses experimentos também foi utilizada a linhagem de T. rubrum pacC-1, que tem o seu gene pacC rompido, com o objetivo de verificar se estes genes isolados seriam regulados pela proteína PacC. O gene pacC codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional PacC/Rim101p da conservada via de sinalização do pH. Verificamos que o gene pacC se expressa preferencialmente em pH 8.0 e que embora o padrão de processamento da proteína PacC seja dependente do pH a forma íntegra da proteína PacC foi identificada tanto em pH ácido como alcalino. Por outro lado, o mutante pacC-1 apresentou diminuida capacidade infectiva em fragmentos de unha humana quando comparado com a linhagem selvagem. Além disto, a atividade queratínolitica do mutante também se mostrou diminuída quando comparada ao controle, confirmando o papel da proteína PacC na capacidade infectiva do T. rubrum. / Dermatophytosis is commonly caused by fungi that parasite human skin and nail, whose propagation depends on the contact between infected and noninfected hosts. Many factors contribute to the pathogenicity of the dermatophytes. Among them, the capacity to install in the skin´s acid ambient bears great importance. Thus, in order to be successful, the dermatophyte needs to have adhering capacity, fast germination and penetration of hyphae and, therefore, needs to afford a metabolic machinery which acts efficiently in acid pH. In order to identify genes supposedly expressed in the initial steps of infection, we submitted the strain H6 of the dermatophyte T. rubrum to the acid pH for 30 minutes and 1 hour and isolated, from this experimental conditions, the transcripts with high expression, employing the suppression subtractive hybridization (SSH). We obtained a total of 234 unigenes whose transcripts revealed a wide functional diversity. These transcripts are involved in 13 different cell processes, such as metabolism, defense and virulence, protein synthesis and cell transport. Among these, we confirmed through Northern blotting the genes which express the proteins carboxipeptidase S1, acetamidase, aconitase, fatty acid desaturase, NIMA interactive protein (TINA), amino acid permease, elongation factor 1-alpha, 60S ribosomal protein L10 and a hypothetical protein. In these experiments, we also used the T. rubrum pacC- 1 strain, which has its pacC gene disrupted, aiming at verifying whether these isolated genes would be regulated by the PacC protein. The pacC gene encodes a protein homologous to the PacC/Rim101p transcriptional regulator of the conserved route of pH signaling. We verified that the pacC gene is expressed preferentially in both pH, and that although the processing pattern of the PacC protein is dependent on the pH, the full form of the PacC was identified as alkaline. On the other hand, the pacC-1 mutant presented diminished infecting capacity in human nail fragments when compared to the wild strain. Moreover, the keratinolytic activity of the mutant also seemed diminished when compared to the control, confirming the role of the PacC protein in the infecting capacity of T. rubrum.

Dermatofitoses são comumente causadas por fungos que parasitam pele e unha de humanos, cuja propagação depende do contato entre os hospedeiros infectados e não infectados. Muitos fatores contribuem para a patogenicidade dos dermatófitos, dentre eles, a capacidade de se instalar no ambiente ácido da pele se reveste de importância. Sendo assim, para ser bem sucedido, o dermatófito precisa ter capacidade aderente, germinação e penetração rápida das hifas e, portanto, dispor de uma maquinaria metabólica que atue de forma eficiente em pH ácido. A fim de identificar genes supostamente expressos nos passos iniciais da infecção, submetemos a linhagem H6 do dermatófito T. rubrum ao pH ácido por 30 minutos e 1 hora e isolamos dessas condições experimentais os transcritos com elevada expressão, empregando a metodologia de Biblioteca Subtrativa Supressiva (SSH). Obtivemos um total de 234 unigenes cujos transcritos revelaram ampla diversidade funcional. Esses transcritos estão envolvidos em 13 processos celulares diferentes, tais como, metabolismo, defesa e virulência, síntese de proteínas e transporte celular. Desses, confirmamos por Northern blotting, os genes que expressam as proteínas carboxipeptidase S1, acetoamidase, aconitase, dessaturase, a proteína TINA, transportador de aminoácidos, fator de alongamento alfa 1, proteína ribossomal L10, e uma proteína hipotética. Nesses experimentos também foi utilizada a linhagem de T. rubrum pacC-1, que tem o seu gene pacC rompido, com o objetivo de verificar se estes genes isolados seriam regulados pela proteína PacC. O gene pacC codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional PacC/Rim101p da conservada via de sinalização do pH. Verificamos que o gene pacC se expressa preferencialmente em pH 8.0 e que embora o padrão de processamento da proteína PacC seja dependente do pH a forma íntegra da proteína PacC foi identificada tanto em pH ácido como alcalino. Por outro lado, o mutante pacC-1 apresentou diminuida capacidade infectiva em fragmentos de unha humana quando comparado com a linhagem selvagem. Além disto, a atividade queratínolitica do mutante também se mostrou diminuída quando comparada ao controle, confirmando o papel da proteína PacC na capacidade infectiva do T. rubrum. / Dermatophytosis is commonly caused by fungi that parasite human skin and nail, whose propagation depends on the contact between infected and noninfected hosts. Many factors contribute to the pathogenicity of the dermatophytes. Among them, the capacity to install in the skin´s acid ambient bears great importance. Thus, in order to be successful, the dermatophyte needs to have adhering capacity, fast germination and penetration of hyphae and, therefore, needs to afford a metabolic machinery which acts efficiently in acid pH. In order to identify genes supposedly expressed in the initial steps of infection, we submitted the strain H6 of the dermatophyte T. rubrum to the acid pH for 30 minutes and 1 hour and isolated, from this experimental conditions, the transcripts with high expression, employing the suppression subtractive hybridization (SSH). We obtained a total of 234 unigenes whose transcripts revealed a wide functional diversity. These transcripts are involved in 13 different cell processes, such as metabolism, defense and virulence, protein synthesis and cell transport. Among these, we confirmed through Northern blotting the genes which express the proteins carboxipeptidase S1, acetamidase, aconitase, fatty acid desaturase, NIMA interactive protein (TINA), amino acid permease, elongation factor 1-alpha, 60S ribosomal protein L10 and a hypothetical protein. In these experiments, we also used the T. rubrum pacC- 1 strain, which has its pacC gene disrupted, aiming at verifying whether these isolated genes would be regulated by the PacC protein. The pacC gene encodes a protein homologous to the PacC/Rim101p transcriptional regulator of the conserved route of pH signaling. We verified that the pacC gene is expressed preferentially in both pH, and that although the processing pattern of the PacC protein is dependent on the pH, the full form of the PacC was identified as alkaline. On the other hand, the pacC-1 mutant presented diminished infecting capacity in human nail fragments when compared to the wild strain. Moreover, the keratinolytic activity of the mutant also seemed diminished when compared to the control, confirming the role of the PacC protein in the infecting capacity of T. rubrum.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 427044 bytes, checksum: 5c1651c701a5ae2b53e04e42782f989e (MD5) Previous issue date: 2007-09-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Infectious bursal disease (IBD) has been the major preoccupation for the poultry industry, especially in the past decade with the emergency of high virulent strains. Mutations in the gene that code the VP2 viral protein of pathogenic strains and the amiss use of attenuate vaccines by few passages have been responsible for the springing of new outbreaks. The purpose of this work was to analyze phylogenetically two different isolates of IBDV in Minas Gerais State by the comparison of the nucleotide sequence of the gene that code VP2 viral capside protein. In order to study the pathogen-host interaction, a subtractive library was constructed from VERO cells infected by IBDV (8 hours post-infection) aiming the identification of differential gene expression during this interaction. For the phylogenic analysis of the isolates, fragments of 251 bp amplified by RT-PCR were cloned and sequenced. The comparison of the sequences revealed that these isolates have 98-100% identity with classical vaccinal IBDV strains indicating that these outbreaks might have been caused by the vaccinal virus. To construct the subtractive library, two cDNA populations were hibridizated: one derived by IBDV infected VERO cells and other by non infected VERO cells. The hibridizated products were amplified for the posterior cloning and evaluation of the differential express products. Understanding of the replication characteristics of the IBDV associated to the study of the virus infection effects in the gene expression of the host cell, shown in this work, will allow the elucidation of the mechanisms involved in the pathogen-host interaction contributing, therefore, for the development of methods more effectives in the control and prevention of the IBDV. / A doença infecciosa bursal (IBD) tem sido, há muitos anos, uma grande preocupação para a indústria avícola, especialmente na década passada devido a emergência de cepas virais hipervirulentas. Mutações no gene responsável pela codificação da proteína viral VP2 de linhagens patogênicas e a má utilização de vacinas atenuadas por poucas passagens têm sido responsáveis pelo aparecimento de novos surtos. A proposta deste trabalho foi analisar filogeneticamente dois diferentes isolados de IBDV de Minas Gerais por meio da comparação da seqüência nucleotídica do gene que codifica a proteína do capsídeo viral VP2. Em razão da necessidade de se estudar melhor a interação patógeno-hospedeiro, objetivou-se ainda a construção de uma biblioteca subtrativa a partir de células VERO infectadas pelo IBDV, 8 horas após a infecção, com a finalidade de identificar genes diferencialmente expressos durante essa interação vírus-célula hospedeira. Para a análise filogenética dos isolados, fragmentos de 251 pb amplificados por RT-PCR foram clonados e seqüenciados. A comparação das seqüências revelou que os isolados possuem identidade de 98-100% com linhagens clássicas vacinais de IBDV, indicando que os surtos analisados podem ter sido causados pelo vírus vacinal. Para a construção da biblioteca subtrativa, duas populações de cDNA foram hibridizadas: uma derivada de células VERO infectadas por IBDV e a outra de células VERO não infectadas. Os produtos hibridizados foram amplificados para posterior clonagem e avaliação dos produtos diferencialmente expressos. O conhecimento das características replicativas do IBDV associado ao estudo das conseqüências da infecção pelo vírus na expressão gênica da célula hospedeira, iniciado neste trabalho, permitirá a elucidação dos mecanismos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro, contribuindo assim para o desenvolvimento de métodos mais eficazes no controle e prevenção da IBD.

O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa) sendo esta a espécie de maior expressão comercial dentre as passifloras cultivadas. A bacteriose do maracujazeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap), é uma das doenças mais severas da cultura, acarretando grandes prejuízos aos produtores. Atualmente, é incipiente o conhecimento sobre a interação maracujá azedo-Xap. Diante disso, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos no processo de defesa são passos importantes para dar suporte ao desenvolvimento de variedades resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar genes de maracujá azedo diferencialmente expressos durante a resposta de defesa à Xap, bem como mensurar a sua expressão. Para isso, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (forward e reverse) usando o método SSH a partir de transcritos de folhas, que foram inoculadas com o patógeno ou solução salina (controle). Após o sequenciamento dos clones, o processamento e a montagem das sequências, as unisequências foram anotadas através da Plataforma PLAZA e do programa computacional Blast2GO. Genes envolvidos em diversos processos biológicos foram selecionados para a validação das bibliotecas por PCR quantitativo. Usando a Plataforma PLAZA, 78 % (764) das unisequências mostraram similaridade com proteínas de Arabidopsis thaliana, enquanto 87 % (866) delas apresentaram similaridade com proteínas putativas de diversas espécies vegetais, quando se utilizou Blast2GO. Na biblioteca forward, foram identificadas 73 proteínas relacionadas à resposta de defesa, dentre as quais estão proteínas envolvidas na sinalização intracelular, na ativação da transcrição e regulação da expressão de genes de defesa, bem como proteínas de defesa, de resistência e relacionadas à patogênese (PRs). Dentre os 22 transcritos validados, 95 % foram diferencialmente expressos em pelo menos um dos três períodos avaliados; os genes mais expressos em resposta à infecção pelo patógeno são os que codificam as enzimas lipoxigenase, (+)-neomentol desidrogenase e quitinase, as quais participam diretamente nas respostas de defesa vegetal. Dos genes cuja expressão foi mais reprimida, dois codificam proteínas relacionadas à fotossíntese e dois codificam proteínas envolvidas na detoxificação da amônia e do H2O2. Nossos resultados sugerem que a planta utiliza um arsenal de transcritos para responder à infecção; entretanto, este arsenal não é eficiente para impedir a ação do patógeno e, consequentemente, o desenvolvimento da bacteriose nas condições estudadas. Nosso estudo é inédito e gerou informações sobre a reprogramação transcricional durante a interação maracujá azedo-Xap, o que constitui um importante passo para o melhor entendimento sobre este patossistema. / Brazil is the main producer of yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) worldwide, which is the most widely commercialized crop among the cultivated passifloras. The bacterial leaf spot induced by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap) is one of the most severe diseases of the crop, causing great losses to producers. Currently, we understand very little about the yellow passion fruit-Xap interaction. Therefore, the identification and characterization of genes involved in the defense process are important steps to support the development of resistant varieties. Thus, the objective of this study was identify and characterize differentially expressed genes during the defense response to Xap, as well as to measure their expression. For that, we constructed two subtractive cDNA libraries (the forward and the reverse) by performing the SSH method from leaf transcripts, which were inoculated with the pathogen or saline solution (control). After sequencing the clones and sequence data processing, sequences were assembled into unique sequences, which were annotated using the PLAZA Platform and the computational program Blast2GO. Genes involved in several biological processes were selected to validate the libraries by quantitative PCR. When PLAZA was used for sequence similarity searches, 78 % (764) of the yellow passion fruit unique sequences showed similarity to proteins of Arabidopsis thaliana; when Blast2GO was used, 87 % (866) of the unique sequences showed similarities to putative proteins of several plant species. For the forward library, 73 proteins related to defense response were identified, such as those involved in intracellular signaling, transcription activation and regulation of defense gene expression, as well as defense and resistance proteins, and pathogenesis-related proteins (PRs). Of the 22 validated transcripts, 95 % were differentially expressed during at least one of the three periods evaluated; the genes up-regulated in response to the pathogen infection were those that code for the enzymes lipoxygenase, (+)-neomenthol dehydrogenase and chitinase, which participate directly in plant-defense responses. Out of down-regulated genes, two code for photosynthesis-related proteins, and two for ammonia and H2O2 detoxification. Our results suggest the plant uses an arsenal of transcripts to respond to infection; however, this arsenal is not effective to prevent pathogen action and consequently the occurrence of bacterial leaf spot under the evaluated conditions. The present study is the first to produce information on the transcriptional reprogramming during the passion fruit-Xap interaction, which represents an important step for a better understanding of this pathosystem.

O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa) sendo esta a espécie de maior expressão comercial dentre as passifloras cultivadas. A bacteriose do maracujazeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap), é uma das doenças mais severas da cultura, acarretando grandes prejuízos aos produtores. Atualmente, é incipiente o conhecimento sobre a interação maracujá azedo-Xap. Diante disso, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos no processo de defesa são passos importantes para dar suporte ao desenvolvimento de variedades resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar genes de maracujá azedo diferencialmente expressos durante a resposta de defesa à Xap, bem como mensurar a sua expressão. Para isso, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (forward e reverse) usando o método SSH a partir de transcritos de folhas, que foram inoculadas com o patógeno ou solução salina (controle). Após o sequenciamento dos clones, o processamento e a montagem das sequências, as unisequências foram anotadas através da Plataforma PLAZA e do programa computacional Blast2GO. Genes envolvidos em diversos processos biológicos foram selecionados para a validação das bibliotecas por PCR quantitativo. Usando a Plataforma PLAZA, 78 % (764) das unisequências mostraram similaridade com proteínas de Arabidopsis thaliana, enquanto 87 % (866) delas apresentaram similaridade com proteínas putativas de diversas espécies vegetais, quando se utilizou Blast2GO. Na biblioteca forward, foram identificadas 73 proteínas relacionadas à resposta de defesa, dentre as quais estão proteínas envolvidas na sinalização intracelular, na ativação da transcrição e regulação da expressão de genes de defesa, bem como proteínas de defesa, de resistência e relacionadas à patogênese (PRs). Dentre os 22 transcritos validados, 95 % foram diferencialmente expressos em pelo menos um dos três períodos avaliados; os genes mais expressos em resposta à infecção pelo patógeno são os que codificam as enzimas lipoxigenase, (+)-neomentol desidrogenase e quitinase, as quais participam diretamente nas respostas de defesa vegetal. Dos genes cuja expressão foi mais reprimida, dois codificam proteínas relacionadas à fotossíntese e dois codificam proteínas envolvidas na detoxificação da amônia e do H2O2. Nossos resultados sugerem que a planta utiliza um arsenal de transcritos para responder à infecção; entretanto, este arsenal não é eficiente para impedir a ação do patógeno e, consequentemente, o desenvolvimento da bacteriose nas condições estudadas. Nosso estudo é inédito e gerou informações sobre a reprogramação transcricional durante a interação maracujá azedo-Xap, o que constitui um importante passo para o melhor entendimento sobre este patossistema. / Brazil is the main producer of yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) worldwide, which is the most widely commercialized crop among the cultivated passifloras. The bacterial leaf spot induced by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap) is one of the most severe diseases of the crop, causing great losses to producers. Currently, we understand very little about the yellow passion fruit-Xap interaction. Therefore, the identification and characterization of genes involved in the defense process are important steps to support the development of resistant varieties. Thus, the objective of this study was identify and characterize differentially expressed genes during the defense response to Xap, as well as to measure their expression. For that, we constructed two subtractive cDNA libraries (the forward and the reverse) by performing the SSH method from leaf transcripts, which were inoculated with the pathogen or saline solution (control). After sequencing the clones and sequence data processing, sequences were assembled into unique sequences, which were annotated using the PLAZA Platform and the computational program Blast2GO. Genes involved in several biological processes were selected to validate the libraries by quantitative PCR. When PLAZA was used for sequence similarity searches, 78 % (764) of the yellow passion fruit unique sequences showed similarity to proteins of Arabidopsis thaliana; when Blast2GO was used, 87 % (866) of the unique sequences showed similarities to putative proteins of several plant species. For the forward library, 73 proteins related to defense response were identified, such as those involved in intracellular signaling, transcription activation and regulation of defense gene expression, as well as defense and resistance proteins, and pathogenesis-related proteins (PRs). Of the 22 validated transcripts, 95 % were differentially expressed during at least one of the three periods evaluated; the genes up-regulated in response to the pathogen infection were those that code for the enzymes lipoxygenase, (+)-neomenthol dehydrogenase and chitinase, which participate directly in plant-defense responses. Out of down-regulated genes, two code for photosynthesis-related proteins, and two for ammonia and H2O2 detoxification. Our results suggest the plant uses an arsenal of transcripts to respond to infection; however, this arsenal is not effective to prevent pathogen action and consequently the occurrence of bacterial leaf spot under the evaluated conditions. The present study is the first to produce information on the transcriptional reprogramming during the passion fruit-Xap interaction, which represents an important step for a better understanding of this pathosystem.