Dermatofitoses são comumente causadas por fungos que parasitam pele e unha de humanos, cuja propagação depende do contato entre os hospedeiros infectados e não infectados. Muitos fatores contribuem para a patogenicidade dos dermatófitos, dentre eles, a capacidade de se instalar no ambiente ácido da pele se reveste de importância. Sendo assim, para ser bem sucedido, o dermatófito precisa ter capacidade aderente, germinação e penetração rápida das hifas e, portanto, dispor de uma maquinaria metabólica que atue de forma eficiente em pH ácido. A fim de identificar genes supostamente expressos nos passos iniciais da infecção, submetemos a linhagem H6 do dermatófito T. rubrum ao pH ácido por 30 minutos e 1 hora e isolamos dessas condições experimentais os transcritos com elevada expressão, empregando a metodologia de Biblioteca Subtrativa Supressiva (SSH). Obtivemos um total de 234 unigenes cujos transcritos revelaram ampla diversidade funcional. Esses transcritos estão envolvidos em 13 processos celulares diferentes, tais como, metabolismo, defesa e virulência, síntese de proteínas e transporte celular. Desses, confirmamos por Northern blotting, os genes que expressam as proteínas carboxipeptidase S1, acetoamidase, aconitase, dessaturase, a proteína TINA, transportador de aminoácidos, fator de alongamento alfa 1, proteína ribossomal L10, e uma proteína hipotética. Nesses experimentos também foi utilizada a linhagem de T. rubrum pacC-1, que tem o seu gene pacC rompido, com o objetivo de verificar se estes genes isolados seriam regulados pela proteína PacC. O gene pacC codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional PacC/Rim101p da conservada via de sinalização do pH. Verificamos que o gene pacC se expressa preferencialmente em pH 8.0 e que embora o padrão de processamento da proteína PacC seja dependente do pH a forma íntegra da proteína PacC foi identificada tanto em pH ácido como alcalino. Por outro lado, o mutante pacC-1 apresentou diminuida capacidade infectiva em fragmentos de unha humana quando comparado com a linhagem selvagem. Além disto, a atividade queratínolitica do mutante também se mostrou diminuída quando comparada ao controle, confirmando o papel da proteína PacC na capacidade infectiva do T. rubrum. / Dermatophytosis is commonly caused by fungi that parasite human skin and nail, whose propagation depends on the contact between infected and noninfected hosts. Many factors contribute to the pathogenicity of the dermatophytes. Among them, the capacity to install in the skin´s acid ambient bears great importance. Thus, in order to be successful, the dermatophyte needs to have adhering capacity, fast germination and penetration of hyphae and, therefore, needs to afford a metabolic machinery which acts efficiently in acid pH. In order to identify genes supposedly expressed in the initial steps of infection, we submitted the strain H6 of the dermatophyte T. rubrum to the acid pH for 30 minutes and 1 hour and isolated, from this experimental conditions, the transcripts with high expression, employing the suppression subtractive hybridization (SSH). We obtained a total of 234 unigenes whose transcripts revealed a wide functional diversity. These transcripts are involved in 13 different cell processes, such as metabolism, defense and virulence, protein synthesis and cell transport. Among these, we confirmed through Northern blotting the genes which express the proteins carboxipeptidase S1, acetamidase, aconitase, fatty acid desaturase, NIMA interactive protein (TINA), amino acid permease, elongation factor 1-alpha, 60S ribosomal protein L10 and a hypothetical protein. In these experiments, we also used the T. rubrum pacC- 1 strain, which has its pacC gene disrupted, aiming at verifying whether these isolated genes would be regulated by the PacC protein. The pacC gene encodes a protein homologous to the PacC/Rim101p transcriptional regulator of the conserved route of pH signaling. We verified that the pacC gene is expressed preferentially in both pH, and that although the processing pattern of the PacC protein is dependent on the pH, the full form of the PacC was identified as alkaline. On the other hand, the pacC-1 mutant presented diminished infecting capacity in human nail fragments when compared to the wild strain. Moreover, the keratinolytic activity of the mutant also seemed diminished when compared to the control, confirming the role of the PacC protein in the infecting capacity of T. rubrum.

Dermatofitoses são comumente causadas por fungos que parasitam pele e unha de humanos, cuja propagação depende do contato entre os hospedeiros infectados e não infectados. Muitos fatores contribuem para a patogenicidade dos dermatófitos, dentre eles, a capacidade de se instalar no ambiente ácido da pele se reveste de importância. Sendo assim, para ser bem sucedido, o dermatófito precisa ter capacidade aderente, germinação e penetração rápida das hifas e, portanto, dispor de uma maquinaria metabólica que atue de forma eficiente em pH ácido. A fim de identificar genes supostamente expressos nos passos iniciais da infecção, submetemos a linhagem H6 do dermatófito T. rubrum ao pH ácido por 30 minutos e 1 hora e isolamos dessas condições experimentais os transcritos com elevada expressão, empregando a metodologia de Biblioteca Subtrativa Supressiva (SSH). Obtivemos um total de 234 unigenes cujos transcritos revelaram ampla diversidade funcional. Esses transcritos estão envolvidos em 13 processos celulares diferentes, tais como, metabolismo, defesa e virulência, síntese de proteínas e transporte celular. Desses, confirmamos por Northern blotting, os genes que expressam as proteínas carboxipeptidase S1, acetoamidase, aconitase, dessaturase, a proteína TINA, transportador de aminoácidos, fator de alongamento alfa 1, proteína ribossomal L10, e uma proteína hipotética. Nesses experimentos também foi utilizada a linhagem de T. rubrum pacC-1, que tem o seu gene pacC rompido, com o objetivo de verificar se estes genes isolados seriam regulados pela proteína PacC. O gene pacC codifica uma proteína homóloga ao regulador transcricional PacC/Rim101p da conservada via de sinalização do pH. Verificamos que o gene pacC se expressa preferencialmente em pH 8.0 e que embora o padrão de processamento da proteína PacC seja dependente do pH a forma íntegra da proteína PacC foi identificada tanto em pH ácido como alcalino. Por outro lado, o mutante pacC-1 apresentou diminuida capacidade infectiva em fragmentos de unha humana quando comparado com a linhagem selvagem. Além disto, a atividade queratínolitica do mutante também se mostrou diminuída quando comparada ao controle, confirmando o papel da proteína PacC na capacidade infectiva do T. rubrum. / Dermatophytosis is commonly caused by fungi that parasite human skin and nail, whose propagation depends on the contact between infected and noninfected hosts. Many factors contribute to the pathogenicity of the dermatophytes. Among them, the capacity to install in the skin´s acid ambient bears great importance. Thus, in order to be successful, the dermatophyte needs to have adhering capacity, fast germination and penetration of hyphae and, therefore, needs to afford a metabolic machinery which acts efficiently in acid pH. In order to identify genes supposedly expressed in the initial steps of infection, we submitted the strain H6 of the dermatophyte T. rubrum to the acid pH for 30 minutes and 1 hour and isolated, from this experimental conditions, the transcripts with high expression, employing the suppression subtractive hybridization (SSH). We obtained a total of 234 unigenes whose transcripts revealed a wide functional diversity. These transcripts are involved in 13 different cell processes, such as metabolism, defense and virulence, protein synthesis and cell transport. Among these, we confirmed through Northern blotting the genes which express the proteins carboxipeptidase S1, acetamidase, aconitase, fatty acid desaturase, NIMA interactive protein (TINA), amino acid permease, elongation factor 1-alpha, 60S ribosomal protein L10 and a hypothetical protein. In these experiments, we also used the T. rubrum pacC- 1 strain, which has its pacC gene disrupted, aiming at verifying whether these isolated genes would be regulated by the PacC protein. The pacC gene encodes a protein homologous to the PacC/Rim101p transcriptional regulator of the conserved route of pH signaling. We verified that the pacC gene is expressed preferentially in both pH, and that although the processing pattern of the PacC protein is dependent on the pH, the full form of the PacC was identified as alkaline. On the other hand, the pacC-1 mutant presented diminished infecting capacity in human nail fragments when compared to the wild strain. Moreover, the keratinolytic activity of the mutant also seemed diminished when compared to the control, confirming the role of the PacC protein in the infecting capacity of T. rubrum.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-03T17:06:06Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2556158 bytes, checksum: 27b067863ed5da400bb343a3468852f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-03T17:06:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2556158 bytes, checksum: 27b067863ed5da400bb343a3468852f4 (MD5) Previous issue date: 2005-04-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Meloidogyne incognita é um nematóide endoparasita sedentário que induz a formação de galhas nas raízes das plantas suscetíveis. Em tomateiros com o gene Mi-1, as células próximas ao estilete dos juvenis de segundo estágio exibem reação de hipersensibilidade (HR) a partir de oito a doze horas após a inoculação. Esse trabalho objetivou identificar e caracterizar parcialmente genes envolvidos nas vias de transdução de sinais e nas respostas de defesa do tomateiro a Meloidogyne incógnita mediadas pelo gene Mi-1 utilizando a técnica de hibridização subtrativa seguida de amplificação por PCR (suppressive subtractive hybridization, SSH). A partir dos cultivares quase isogênicas de tomateiros Moneymaker (suscetível) e Motelle (resistente) inoculados com M. incognita foram construídas duas bibliotecas subtrativas enriquecidas para genes diferencialmente expressos na interação incompatível (MoI 24h e MoI 72h) e uma biblioteca para a interação compatível (MMI 24h). Foram seqüenciados 81 clones da biblioteca MoI 72h, 26 da MMI 24h e 620 da MoI 24h. As análises subseqüentes se concentraram nesta última porque as outras duas apresentaram elevada redundância ou muitos ESTs (Expressed Sequence Tags) com similaridade a genes não caracterizados. Na análise de expressão por macroarranjo, 126 (41%) entre os 307 clones não redundantes de cDNAs apresentaram expressão diferencial. A análise de Northern blot não apresentou sensibilidade suficiente para evidenciar diferenças nos níveis de expressão. Vinte e um genes foram submetidos à análise de expressão por PCR quantitativa e, entre estes, oito apresentaram indução duas horas após a inoculação. A classificação dos ESTs em categorias funcionais em potencial mostrou que 31% deles têm relação com resposta de resistência, resposta a patógenos, proteção à célula, sinalização celular ou a estresse abiótico. Os ESTs classificados como não caracterizados corresponderam a 26%. Entre os ESTs com similaridade a genes induzidos nessa interação relatados previamente, estão inibidores de proteases, quitinase, aquaporina, fenilalanina amônia liase, Ki1 e peroxidase. Entre os ESTs relacionados com defesa relatados em outros patossistemas estão os similares a genes que codificam para MAPK4, defensinas, proteínas de transferência de lipídios, PR10 e proteína 14-3-3. Os genes semelhantes a MtN19, D13F MYB ST1 e cinase dependente de cálcio parecem apresentar mais de uma cópia no genoma e os genes semelhantes a Myb1, gene relacionado à resposta de resistência, gene envolvido com a resistência sistêmica adquirida, Ki1 e a defensina parecem estar presentes em cópia única no genoma. Os transcritos dos genes correspondentes aos clones SSH08D08 (MtN19), SSH09A10 (peroxidase 10), SSH10H09 (semelhante a Ki1) e SSH09D04 (defensina) possuem cerca de 2,5 kb, 1,2 kb, 1,8 kb e 0,5 kb, respectivamente. A presença de muitos genes relacionados com defesa e a ausência de genes do patógeno na biblioteca demonstra que a subtração foi eficiente para enriquecer para genes diferencialmente expressos. A grande quantidade de genes identificados e parcialmente caracterizados fornece subsídios para o estudo funcional visando caracterizar as vias de respostas de defesa mediadas pelo gene Mi-1. / In the compatible interaction between tomato and root-knot nematode Meloidogyne incognita, galls are formed on the roots. The tomato gene Mi-1 confers resistance to M. incognita accompanied by a hypersensitive response. To elucidate the mechanisms underlying these interactions, three cDNA libraries enriched for transcripts differentially expressed in susceptible (MMI 24h) and in resistant (MoI 24h and MoI 72h) plants, respectively, were generated by suppressive subtractive hybridization (SSH). Twenty-six ESTs were generated from MMI 24h, 81 from MoI 72h and 620 from MoI 24h library. The library MoI 24 was further characterized because the first two were highly redundant or had many ESTs similar to unknown genes. The cDNA macroarray analysis of 307 nonredundant clones revealed that 126 (41%) corresponded to differentially expressed transcripts. Northern blot analysis did not show enough sensitivity to detect differential expression. Quantitative PCR was performed to investigate the expression patterns of 21 selected genes. Transcript accumulation occurred for eight out of the 21 genes two hours after M. incognita challenge in resistant plants. Classification of the ESTs into several putative functional categories showed that 31% of these ESTs represented genes involved in resistance response, pathogen and stress response, cell protection or signaling. Twenty-six percent of ESTs corresponded to genes with unknown functions. Among ESTs similar to genes known to be involved in plant- nematode interactions were trypsin-alpha amylase inhibitor, chitinase, aquaporin, phenylalanine ammonia-lyase, Ki1 and peroxidase. Among ESTs similar to genes reported in other pathosystems were MAPK4, defensins, lipid transfer proteins, PR10 and 14-3-3 proteins. The genes similar to MtN19, to D13F MYB ST1 and to calcium-dependent protein kinase 3 apparently are present in more than one copy in the tomato genome and the genes similar to Myb1, to disease resistance response protein, to systemic acquired resistance- related protein, to Ki1 and to plant defensin apparently have only one copy. The transcripts corresponding to SSH08D08 (MtN19), SSH09A10 (peroxidase 10), SSH10H09 (similar to Ki1) and SSH09D04 (plant defensin) clones have approximately 2,5 kb, 1,2 kb, 1,8 kb and 0,5 kb, respectively. The presence of various defense related genes and the absence of pathogen genes in the libraries give evidence of successfully subtraction for genes differentially expressed. The identification and partial characterization of these cDNAs will assist functional analysis aimed to elucidate the pathways activated by the Mi-1 gene.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2015-12-15T17:40:31Z No. of bitstreams: 1 SaraCarolinePintoDeAlmeidaSantos_DISSERT.pdf: 1626880 bytes, checksum: 5e9d43b636158f844f4ee85220213b35 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2015-12-28T22:11:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 SaraCarolinePintoDeAlmeidaSantos_DISSERT.pdf: 1626880 bytes, checksum: 5e9d43b636158f844f4ee85220213b35 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-28T22:11:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SaraCarolinePintoDeAlmeidaSantos_DISSERT.pdf: 1626880 bytes, checksum: 5e9d43b636158f844f4ee85220213b35 (MD5) Previous issue date: 2014-08-21 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / A queima de combust?veis f?sseis destaca-se dentre as atividades humanas como a principal respons?vel pelo aumento de gases poluentes na atmosfera que provocam mudan?as clim?ticas. Diante deste cen?rio, t?m se buscado alternativas menos poluentes e danosas que os combust?veis f?sseis. Muito recurso tem sido investido em pesquisas que visem o conhecimento e produ??o de esp?cies de plantas oleaginosas que possam substituir parte do diesel mineral pelo biodiesel. Dentre estas plantas est? a mamona (Ricinus communis L.), uma planta oleaginosa pertencente ? fam?lia Euphorbiaceae, considerada r?stica e que n?o exige grande disponibilidade de ?gua para seu desenvolvimento e produ??o. Por possuir um ?leo rico em um ?cido graxo incomum (?cido ricinol?ico), tem sido apontada como uma oleaginosa com grande potencial para o cultivo em regi?es semi?ridas, como o Nordeste do Brasil. Esta regi?o ? caracterizada pelos longos per?odos de seca com baixa precipita??o pluviom?trica, al?m de solos salinos. Considerando isto, este trabalho teve como objetivo contribuir para a compreens?o das respostas das plantas de mamona a estresses abi?ticos (h?drico e salino) por meio de an?lises morfofisiol?gicas e moleculares. Para isso, as plantas de mamona foram submetidas a condi??es de estresse salino (50, 100, 150 e 200 mM de NaCl) em ambiente controlado e estresse h?drico (5, 10, 15 dias e 10 dias c?clico). Ap?s os tratamentos, as plantas foram sujeitas a diferentes an?lises quanto ao efeito dos estresses: a) na expans?o e reten??o de ?gua nas folhas; b) no teor de clorofilas; c) nas enzimas do sistema antioxidante (SOD, CAT, APX e POX) em folhas, ra?zes e sementes; d) na anatomia foliar e de ra?zes; e) no teor de ?leo em sementes; f) na express?o diferencial de genes atrav?s de biblioteca subtrativa de cDNA para estresse h?drico em sementes. Diante dos resultados obtidos, verificamos que a mamona sofreu altera??es na atividade de enzimas antioxidantes, com respostas dependendo do n?vel de estresse e tecido-dependente. Nas atividades de SOD e APX em folha foi observada uma diminui??o aos 5 e 10 dias de estresse h?drico, entretanto, em raiz houve um aumento da atividade de SOD aos 10 e 15 dias de estresse e de APX ao 5 e 10 dias. Em semente houve uma diminui??o da atividade de SOD no maior per?odo de estresse. As atividades de CAT e POX em folha apresentaram um aumento aos 10 dias de estresse, o que tamb?m foi observado na atividade de POX em raiz. Altera??es nas estruturas do sistema vascular tamb?m foram observadas, no entanto, inferimos que a mamona pode resistir ao estresse h?drico moderado (5 dias) e ao estresse salino at? 100 mM de NaCl, evitando a perda de ?gua, mantendo o turgor celular. O teor do ?leo n?o sofreu altera??es com o d?ficit h?drico. Os resultados das bibliotecas subtrativas para estresse indicam que existe um aumento na express?o de genes em sementes relacionados ? defesa da planta contra as condi??es de estresse (por exemplo, Dehidrina), assim como, na matura??o e desenvolvimento do embri?o. Os dados obtidos neste trabalho auxiliaram na compreens?o do comportamento da mamona em condi??es de estresse abi?tico, h?drico e salino, assim como, na recupera??o h?drica da planta ap?s a retomada das regas. / The use of fossil fuels has been considered one of reason for the increase of pollution in the atmosphere and it may be related to the climate changes. Then, the research of the new sources of fuels will be important. Considering this, the use of biodiesel has been considered not as bad as petrol. The castor bean (Ricinus communis L.) is an important oilseed, which belongs to Euphorbiaceae family, and the oil found in the seed has important characteristics for biodiesel. This plant is considered as ?rustic? as it does not need so much water for its development and oil production. Due to this, this plant has been considered to be ideal in semi-arid regions, such as the Northeast of Brazil. The aim of his study is to better understand the responses to abiotic stresses (drought and salinity) from castor bean plants using morphological, physiological and molecular tools. In order to do this, the castor bean plants were subjected to salt stress (50, 100, 150 and 200 mM NaCl) in a controlled environment and drought stress (5, 10, 15 days and 10 days cyclic). After these treatments, these plants were subjected to different analyzes: a) the expansion and retention of water from leaves; b) anatomy using leaves and roots. Based on these results, we found that castor suffered decrease in leaf area with increase drought stress, however restricted water loss, probably by accumulation of compatible solutes in the leaves. The anatomy data showed modifications in the vascular system. These modifications observed suggested that castor bean plant may be resistant to stress as it was verified in 5 days of drought as well as in 100 mM NaCl. In both conditions, these plants were fine. Probably these plants keep some solutes in the cell and then maintain the cell tugor. The data obtained in this study gave a better idea how castor bean plant responds to abiotic stress conditions - drought and salt stress

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:30:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leonardo_FlaviaCosta_D.pdf: 6145744 bytes, checksum: 199799932d8959740a6ec52e8963bcb8 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Os cupins são insetos pertencentes à Ordem Isoptera, com mais de 3.000 espécies descritas. São importantes agentes de degradação de madeira e compostos celulósicos em geral. Entretanto, essas mesmas características tornam algumas das espécies danosas por destruírem estruturas de edificações, sendo responsáveis por prejuízos da ordem de milhões de dólares. Uma destas espécies-praga é o Coptotermes gestroi. Originária do sudeste asiático foi introduzida no Brasil no início do século XX, estabelecendo-se ao longo daregião costeira, mas com uma clara expansão para o interior do país. O ciclo de vida de C .gestroi inicia com a eclosão do ovo, a larva originada pode se transformar tanto em um operário (linhagem áptera) como em uma ninfa (linhagem ninfal), a qual pode originar um rei ou uma rainha. Além disso, o operário pode se transformar em soldado, sob indução do hormônio juvenil. Assim sendo, o objetivo do presente trabalho foi a avaliação da expressão gênica nas diversas castas e estágios de vida de C.gestroi visando a identificação de genes relacionados ao ciclo de vida e com possível aplicação biotecnológica. Para isso,foi deita a análise de uma biblioteca de cDNA de cabeça de operários previamente construída. Para melhor compreender genes diferencialmente expressos entre as castas,outras quatro bibliotecas subtrativas foram confeccionadas. Alguns dos genes identificados foram genes selecionados para a validação pelo método de PCR em tempo Real. O seqüenciamento de segunda geração (454) foi realizado com amostras de soldados e operários e mais de 110.000 transcritos foram identificados. Dentre eles destacam-se as Hexamerinas I e II, a epóxido hidroláse do hormônio juvenil e genes relacionados à musculatura. Quanto aos genes com potencial biotecnológico dezenove enzimas envolvidasna quebram da lignocelulose foram identificadas e serão investigadas para confirmar o papel destas neste processo. / Abstract: Termites are insects belonging to the Order Isoptera, with more than 3,000 describedspecies. These insects are important wood and cellulosic compounds degraders. However, these same characteristics make some of them harmful species to mankind, by destroying buildings, accounting for million dollars losses. One of these pest species is Coptotermesgestroi. Originated from Southeast Asia, it was introduced in Brazil in the early twentieth century, establishing colonies along the coastal region, but with a clear expansion into thecountry. The life cycle of C. gestroi works as follows: after hatching from the egg, thelarvae can become either a worker (apterous lineage) or a nymph (nymphal lineage), whichcan lead to a king or a queen. In addition, the worker can become a soldier, under inductionof juvenile hormone. Therefore, the purpose of this study was the evaluation of gene expression in different castes and developmental stages of C.gestroi in order to identifygenes related to different life cycles and biotechnological potential. To accomplish this, weanalized a workers head cDNA library previously prepared. To better understand genes differentially expressed between castes, other four subtractive libraries were constructed. Some of the genes identified were selected for validation by Real Time PCR. Secondgeneration sequencing (454) was performed with samples of workers and soldiers and morethan 110,000 transcripts were identified. Among them stand out Hexamerins I and II, thejuvenile hormone epoxide hydrolase and genes related to muscle formation. As for geneswith biotechnological potential, nineteen enzymes involved in lignocellulose's break downwere identified and will be investigated to confirm their role in this process. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O Brasil é o segundo maior produtor de feijão, sendo a espécie mais cultivada o Phaseolus vulgaris L. Entre as três possíveis safras exploradas no Brasil, aquela que gera a maior produção é a da seca. Por outro lado, como a maioria das lavouras emprega pouca tecnologia, um dos problemas desta cultura é o estresse hídrico, que leva a uma redução na produtividade. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água seria de grande utilidade. Nos últimos anos, muitas informações ômicas do feijoeiro foram geradas, criando uma visão integrada deste organismo e oferecendo uma complexa rede de interações entre genes e seus produtos. Este trabalho teve como objetivo central à identificação de genes diferencialmente expressos no sistema radicular de um genótipo de feijoeiro resistente ao estresse hídrico (BAT 477), quando submetido a uma interrupção de irrigação durante seu desenvolvimento. Foi construída uma biblioteca subtrativa de cDNA (SSH), que representou os genes diferencialmente expressos no genótipo resistente, utilizando-se como driver o genótipo Carioca 80SH (suscetível a seca). Foram obtidos 1572 reads válidos, sendo 931 destes singletons e 189 contigs com uma média de seis reads por cluster. A anotação das sequências foi conduzida via BLASTX, sendo consideradas para anotação somente os melhores resultados dos produtos gênicos similares com E- Value \'<OU=\' 10-5. A classificação funcional foi feita tendo-se como base modelos descritos para plantas (modelo CS e MIPS) e os resultados foram agrupados em seis classes funcionais distintas. As análises de bioinformática ajudaram na identificação de genes descritos como envolvidos na resposta da planta ao estresse hídrico. Entre eles: proteínas do grupo LEA; fatores de transcrição como DREB, NAC e proteínas ricas em leucina; enzimas sintetizadoras de carboidratos incluindo trehalose, sacarose e rhamnose; proteínas ricas em prolina; receptores de hormônios (ABA, etileno); aquaporinas; chaperonas; ubiquitinas; nodulinas; e proteínas associadas à fotossíntese e à respiração. A fim de se obter a validação das ESTs anotadas, foi conduzido um experimento de PCR em tempo real confrontando os padrões de expressão de 15 genes sob quatro tratamentos: ambos os genótipos sob estresse e respectivos controles. Três replicatas biológicas foram adotadas e dois genes de referência (act e skip2) foram escolhidos para normalização interna dos dados. Os padrões de expressão gênica obtidos confirmam a hipótese de que tais genes são mesmo mais expressos no genótipo resistente, embora não sejam exclusivos já que uma quantidade menor de tais transcritos também foi detectada no genótipo suscetível / Brazil is the second biggest producer of common bean, being Phaseolus vulgaris L. the most cultivated species. Among the three possible harvests exploited in Brazil, drought is the one which generates the greatest production. On the other hand, as the majority of the households employees low technology, one of the problems of this culture is drought stress that leads to a reduction in the productivity. So, the identification of gene that controls the mechanisms of defense and adaptation of common bean to the lack of water would be very useful. In the past years, many omics information of common bean have been generated, creating an integrated view of this organism and providing a complex network between genes and its products. The main goal of this work was the identification of differentially expressed genes in a genotype of common bean resistant to drought stress (BAT 477), when submitted to a interruption of irrigation during its development. It was build a cDNA suppression subtractive hybridization library (SSH), which represented the differentially expressed genes, on the resistant genotype, having as driver the genotype Carioca 80SH (susceptible to drought). It was obtained 1572 valid reads, being 931 singletons and 189 contigs, with the average of 6 reads per cluster. The sequences annotation was conducted via BLAST X, considering only the best similarity results with E value \'<OU=\' 10-5. The functional classification was done adopting models described for plants (CS and MIPS) and the results were grouped into six different functional classes. Bioinformatic analyses contribuited to the identification of genes described as involved on plants response to drought stress. Among them: LEA proteins; transcription factors like DREB, NAC and leucine-rich proteins; carbohydrates synthesizers enzymes like the ones for trehalose, sucrose and rhamnose; proline-rich proteins; hormone receptors (ABA and ethylene); aquaporins; chaperones; ubiquitins; nodulins; and proteins associated with photosynthesis and respiration. In order to validate the ESTs annotated, a RT-qPCR experiment was conducted comparing the expression patterns of 15 genes under four treatments: both genotypes under stress and their respective controls. Three technical replicates were used and two reference genes (act and skip2) were chosen for intern data normalization. The gene expression patterns obtained confirm the hypothesis that such genes are more expressed on the resistant genotype although they are not exclusive since a lower levels of these transcripts were also detected in the susceptible genotype

O Brasil é o segundo maior produtor de feijão, sendo a espécie mais cultivada o Phaseolus vulgaris L. Entre as três possíveis safras exploradas no Brasil, aquela que gera a maior produção é a da seca. Por outro lado, como a maioria das lavouras emprega pouca tecnologia, um dos problemas desta cultura é o estresse hídrico, que leva a uma redução na produtividade. Dessa forma, a identificação de genes que controlam os mecanismos de defesa e adaptação do feijoeiro à falta de água seria de grande utilidade. Nos últimos anos, muitas informações ômicas do feijoeiro foram geradas, criando uma visão integrada deste organismo e oferecendo uma complexa rede de interações entre genes e seus produtos. Este trabalho teve como objetivo central à identificação de genes diferencialmente expressos no sistema radicular de um genótipo de feijoeiro resistente ao estresse hídrico (BAT 477), quando submetido a uma interrupção de irrigação durante seu desenvolvimento. Foi construída uma biblioteca subtrativa de cDNA (SSH), que representou os genes diferencialmente expressos no genótipo resistente, utilizando-se como driver o genótipo Carioca 80SH (suscetível a seca). Foram obtidos 1572 reads válidos, sendo 931 destes singletons e 189 contigs com uma média de seis reads por cluster. A anotação das sequências foi conduzida via BLASTX, sendo consideradas para anotação somente os melhores resultados dos produtos gênicos similares com E- Value \'<OU=\' 10-5. A classificação funcional foi feita tendo-se como base modelos descritos para plantas (modelo CS e MIPS) e os resultados foram agrupados em seis classes funcionais distintas. As análises de bioinformática ajudaram na identificação de genes descritos como envolvidos na resposta da planta ao estresse hídrico. Entre eles: proteínas do grupo LEA; fatores de transcrição como DREB, NAC e proteínas ricas em leucina; enzimas sintetizadoras de carboidratos incluindo trehalose, sacarose e rhamnose; proteínas ricas em prolina; receptores de hormônios (ABA, etileno); aquaporinas; chaperonas; ubiquitinas; nodulinas; e proteínas associadas à fotossíntese e à respiração. A fim de se obter a validação das ESTs anotadas, foi conduzido um experimento de PCR em tempo real confrontando os padrões de expressão de 15 genes sob quatro tratamentos: ambos os genótipos sob estresse e respectivos controles. Três replicatas biológicas foram adotadas e dois genes de referência (act e skip2) foram escolhidos para normalização interna dos dados. Os padrões de expressão gênica obtidos confirmam a hipótese de que tais genes são mesmo mais expressos no genótipo resistente, embora não sejam exclusivos já que uma quantidade menor de tais transcritos também foi detectada no genótipo suscetível / Brazil is the second biggest producer of common bean, being Phaseolus vulgaris L. the most cultivated species. Among the three possible harvests exploited in Brazil, drought is the one which generates the greatest production. On the other hand, as the majority of the households employees low technology, one of the problems of this culture is drought stress that leads to a reduction in the productivity. So, the identification of gene that controls the mechanisms of defense and adaptation of common bean to the lack of water would be very useful. In the past years, many omics information of common bean have been generated, creating an integrated view of this organism and providing a complex network between genes and its products. The main goal of this work was the identification of differentially expressed genes in a genotype of common bean resistant to drought stress (BAT 477), when submitted to a interruption of irrigation during its development. It was build a cDNA suppression subtractive hybridization library (SSH), which represented the differentially expressed genes, on the resistant genotype, having as driver the genotype Carioca 80SH (susceptible to drought). It was obtained 1572 valid reads, being 931 singletons and 189 contigs, with the average of 6 reads per cluster. The sequences annotation was conducted via BLAST X, considering only the best similarity results with E value \'<OU=\' 10-5. The functional classification was done adopting models described for plants (CS and MIPS) and the results were grouped into six different functional classes. Bioinformatic analyses contribuited to the identification of genes described as involved on plants response to drought stress. Among them: LEA proteins; transcription factors like DREB, NAC and leucine-rich proteins; carbohydrates synthesizers enzymes like the ones for trehalose, sucrose and rhamnose; proline-rich proteins; hormone receptors (ABA and ethylene); aquaporins; chaperones; ubiquitins; nodulins; and proteins associated with photosynthesis and respiration. In order to validate the ESTs annotated, a RT-qPCR experiment was conducted comparing the expression patterns of 15 genes under four treatments: both genotypes under stress and their respective controls. Three technical replicates were used and two reference genes (act and skip2) were chosen for intern data normalization. The gene expression patterns obtained confirm the hypothesis that such genes are more expressed on the resistant genotype although they are not exclusive since a lower levels of these transcripts were also detected in the susceptible genotype

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:18:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CristianeMF.pdf: 69057 bytes, checksum: 86b55b192a6c5915d66e542325da022c (MD5) Previous issue date: 2007-02-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The northeastern region is responsible to 14.32% of sugarcane national production. This lowered contribution is due to edaphoclimatic condition. Flowering is a vital process to plant which consumes lots of energy and it culminates in a process called isoporization. This one can give in a decreasing of 60% on alcohol and water production. It may consider that cropped sugarcane has a hibrid with octaploid genome, there are varieties with a flowering standard until of non flowering. Using this natural genetic potential on different croppings of sugarcane, the aim of this work was to understand as this process occurs by the usage of subtractive approaches. The total RNA was extracted using Trizol of peaks of merisematics of croppings with induced flowering and other with late flowering. From this total RNA were built four subtractives libraries (B1- induced early flowering subtracted on late flowering not induced; B2- late flowering not induced subtracted induced early flowering; B3- induced early flowering subtracted of not induced early flowering; B02- not induced early flowering subtracted from induced early flowering) using kits Super Smart cDNA synthesis and BD Clontech kit select cDNA subtraction (Clontech). This material was clone don vector pGEM T-easy(Promega) and changed in competent cells of E.coli DH10B. Given analysis sequence was carried out a program BLASTn against database of NCBI and genome of Arabidopsis thaliana, rice and maize. Clones were grouped in 9 different classes according to function. Some factors already related as couples of flower induction were identified at different libraries. And grouped proteins with cell cycle and it controls were presents, mainly kinases proteins. Related factors to proteic sinthesis, metabolism, defence, cell communication were also given in both libraries .Some identified genes did not show similarity on database or homology with hypothesis function, and it can represents new genes to be deposited in international database. These results offers that some identified on sugarcane, classified as on factors classes, cell cycle and cell communication, trough unknown genes, can be linked with genetic changing to the flowering process found in the northeastern region / A regi?o nordeste ? respons?vel por 14,32% da produ??o nacional de cana-de-a??car. Esta contribui??o reduzida ? devido ?s condi??es edafo-clim?ticas da regi?o. A flora??o ? um processo vital para a planta que consome muita energia e culmina num fen?meno denominado de isoporiza??o do colmo. Esta isoporiza??o pode acarretar numa redu??o de at? 60% na produ??o de ?lcool e a??car. Considerando que a cana-de-a??car cultivada corresponde a um h?brido com o genoma octaploide, existem variedades com um padr?o de florescimento precoce at? um padr?o de n?o florescimento. Utilizando este potencial gen?tico natural presente nas diferentes cultivares de cana-de-a??car na regi?o nordeste, o objetivo do presente trabalho foi de compreender como ocorre esse processo de flora??o por meio da metodologia de bibliotecas subtrativas. O RNA total foi extra?do utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de ?pices meristem?ticos de cultivares com florescimento precoce induzida e n?o induzida e outra com florescimento tardio. A partir deste RNA total foram constru?das as quatro bibliotecas subtrativas (B1 florescimento precoce induzida subtra?da da tardia n?o-induzida; B2 florescimento tardio n?o-induzida subtra?do da precoce induzida; B3 precoce induzida subtra?da da precoce n?o-induzida; B02 precoce n?o-induzida subtra?da da precoce induzida), utilizando os kits Super Smart cDNA syntesis e o kit BD Clontech PCR select cDNA subtraction (Clontech). Este material foi clonado no vetor pGEM T-easy (Promega) e transformados em c?lulas competentes de E. coli DH10B. A an?lise das seq??ncias obtidas foi realizada utilizando o programa BLASTn contra o banco de dados do NCBI e do genoma de Arabidopsis thaliana, arroz e milho. Os clones foram agrupados em 9 diferentes classes de acordo com a fun??o. Alguns fatores de transcri??o j? relatados como participantes da via de indu??o floral foram identificados nas diferentes bibliotecas. Al?m disso, prote?nas associadas com o ciclo celular e seu controle tamb?m estavam presentes, destacando-se nesse grupo as prote?nas quinases. Fatores relacionados ? s?ntese prot?ica, metabolismo, defesa, transporte e comunica??o celular, tamb?m foram obtidos em ambas bibliotecas. Alguns genes identificados nas bibliotecas n?o apresentaram similaridade nos bancos de dados ou apresentaram homologia com genes de fun??o hipot?tica, e podem representar novos genes a serem depositados em bancos de dados internacionais. Estes resultados sugerem que alguns dos genes identificados em cana-de-a??car, classificados tanto na classe de fatores de transcri??o, ciclo celular e comunica??o celular, al?m dos genes n?o conhecidos, possam estar associados com a variabilidade gen?tica para o processo de flora??o encontrada na regi?o nordeste

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camillo_LucianaRodrigues_M.pdf: 5919875 bytes, checksum: 5cf571ac0a143a68d6340c3ad3c97f49 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença cancro cítrico, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), emergiu como uma das principais ameaças à citricultura brasileira pois afeta todas as variedades comerciais de citros, diminuindo a produção e qualidade dos frutos e podendo se dispersar rapidamente em áreas de cultivo de citros. Entre os gêneros de Xanthomonas, foram encontrados muitos genes associados com patogenicidade e virulência, entretanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos nas interações entre Xac e laranjeira e os genes envolvidos no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico em folhas de citros (Citrus sinensis) em resposta à infecção por Xac. Neste trabalho, foi analizada a expressão diferencial de genes envolvidos no desenvolvimento do cancro cítrico em folhas de laranja, em resposta à infecção por Xac. Para tanto foram construídas duas bibliotecas de Hibridização Subtrativa Suprimida (SSH) com mRNAs de folhas infiltradas com Xac ou H20 após 10 dias de inoculação. O "screnning" das bibliotecas foi feito por dot blot e 17 genes diferencialmente expressos foram sequenciados e identificados por homologia no banco de dados ncbi-BLAST contra o banco de dados de EST de citros. A expressão gênica diferencial foi analizada por Northern Blot e PCR em tempo real (qPCR). Para complementar nossos dados, a expressão dos 17 genes diferenciais foi aI).alisada a partir de cDNAs de folhas de citros que foram infiltradas com Xac, H20 ou Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), que não é patogênica à laranja, mas causa cancro no limão galego. Nossos resultados demonstraram que Xac e Xaa induzem e reprimem o mesmo grupo de genes, porém em diferentes níveis. Nós identificamos que ambos patóg;enos alteram as vias de transdução de sinal de auxina, tráfico e fusão de vesículas, resposta de defesa e doença, síntese de proteínas e ciclo celular, metabolismo de carbono-nitrogênio e metabolismo secundário. A análise desses genes poderá ser de grande importância para o entendimento dos eventos que levam ao desenvolvimento dos sintomas do cancro / Abstract: The citrus canker disease, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), has emerged as one of the major threats to the Brazilian citriculture because it affects all commercial citrus varieties, decreases the production and quality of the fruits and can spread rapidly in the citrus growing areas. The symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruits and leaves and general tree decline. Within the genus Xanthomonas, several genes have been found associated with pathogenicity and virulence. However, little is known about the mechanisms involved in the Xac- citrus interaction and the development of the canker disease. In this work we analyzed the differential expression of genes involved in the development of the canker disease in sweet orange (Citrus sinensis) leaves in response to Xac infection. Therefore we constructed two Supression Subtracted Hybridization (SSH) libraries with mRNA from leaves infiltrated with Xac or water after 10 days of inoculation. The libraries were screnned by dot blot and the 17 differentially expressed genes were sequenced and identified through BLAST searches against the Citrus EST and protein databases. The differential gene expression was evaluated by Northem blot and Real Time PCR (qPCR). To complement our analysis, the expression of 17 genes was compared in cDNA samples from citrus leaves that had been infilt:r:ated with Xac, water or X axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), wich is not pathogenic to orange but causes canker in key lime. Our results show that Xac and Xaa induce and repress a similar set of genes, however at different leveis. We found that both pathogens altered the pathways of auxin transport and signaling, vesicle trafficking and transport, cell cycle and protein synthesis, photorespiration and disease response. Further analysis of these genes will be of great importance to understand the events triggering the development of the canker symptoms / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa) sendo esta a espécie de maior expressão comercial dentre as passifloras cultivadas. A bacteriose do maracujazeiro, causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap), é uma das doenças mais severas da cultura, acarretando grandes prejuízos aos produtores. Atualmente, é incipiente o conhecimento sobre a interação maracujá azedo-Xap. Diante disso, a identificação e a caracterização dos genes envolvidos no processo de defesa são passos importantes para dar suporte ao desenvolvimento de variedades resistentes. Assim, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar genes de maracujá azedo diferencialmente expressos durante a resposta de defesa à Xap, bem como mensurar a sua expressão. Para isso, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (forward e reverse) usando o método SSH a partir de transcritos de folhas, que foram inoculadas com o patógeno ou solução salina (controle). Após o sequenciamento dos clones, o processamento e a montagem das sequências, as unisequências foram anotadas através da Plataforma PLAZA e do programa computacional Blast2GO. Genes envolvidos em diversos processos biológicos foram selecionados para a validação das bibliotecas por PCR quantitativo. Usando a Plataforma PLAZA, 78 % (764) das unisequências mostraram similaridade com proteínas de Arabidopsis thaliana, enquanto 87 % (866) delas apresentaram similaridade com proteínas putativas de diversas espécies vegetais, quando se utilizou Blast2GO. Na biblioteca forward, foram identificadas 73 proteínas relacionadas à resposta de defesa, dentre as quais estão proteínas envolvidas na sinalização intracelular, na ativação da transcrição e regulação da expressão de genes de defesa, bem como proteínas de defesa, de resistência e relacionadas à patogênese (PRs). Dentre os 22 transcritos validados, 95 % foram diferencialmente expressos em pelo menos um dos três períodos avaliados; os genes mais expressos em resposta à infecção pelo patógeno são os que codificam as enzimas lipoxigenase, (+)-neomentol desidrogenase e quitinase, as quais participam diretamente nas respostas de defesa vegetal. Dos genes cuja expressão foi mais reprimida, dois codificam proteínas relacionadas à fotossíntese e dois codificam proteínas envolvidas na detoxificação da amônia e do H2O2. Nossos resultados sugerem que a planta utiliza um arsenal de transcritos para responder à infecção; entretanto, este arsenal não é eficiente para impedir a ação do patógeno e, consequentemente, o desenvolvimento da bacteriose nas condições estudadas. Nosso estudo é inédito e gerou informações sobre a reprogramação transcricional durante a interação maracujá azedo-Xap, o que constitui um importante passo para o melhor entendimento sobre este patossistema. / Brazil is the main producer of yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa) worldwide, which is the most widely commercialized crop among the cultivated passifloras. The bacterial leaf spot induced by Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae (Xap) is one of the most severe diseases of the crop, causing great losses to producers. Currently, we understand very little about the yellow passion fruit-Xap interaction. Therefore, the identification and characterization of genes involved in the defense process are important steps to support the development of resistant varieties. Thus, the objective of this study was identify and characterize differentially expressed genes during the defense response to Xap, as well as to measure their expression. For that, we constructed two subtractive cDNA libraries (the forward and the reverse) by performing the SSH method from leaf transcripts, which were inoculated with the pathogen or saline solution (control). After sequencing the clones and sequence data processing, sequences were assembled into unique sequences, which were annotated using the PLAZA Platform and the computational program Blast2GO. Genes involved in several biological processes were selected to validate the libraries by quantitative PCR. When PLAZA was used for sequence similarity searches, 78 % (764) of the yellow passion fruit unique sequences showed similarity to proteins of Arabidopsis thaliana; when Blast2GO was used, 87 % (866) of the unique sequences showed similarities to putative proteins of several plant species. For the forward library, 73 proteins related to defense response were identified, such as those involved in intracellular signaling, transcription activation and regulation of defense gene expression, as well as defense and resistance proteins, and pathogenesis-related proteins (PRs). Of the 22 validated transcripts, 95 % were differentially expressed during at least one of the three periods evaluated; the genes up-regulated in response to the pathogen infection were those that code for the enzymes lipoxygenase, (+)-neomenthol dehydrogenase and chitinase, which participate directly in plant-defense responses. Out of down-regulated genes, two code for photosynthesis-related proteins, and two for ammonia and H2O2 detoxification. Our results suggest the plant uses an arsenal of transcripts to respond to infection; however, this arsenal is not effective to prevent pathogen action and consequently the occurrence of bacterial leaf spot under the evaluated conditions. The present study is the first to produce information on the transcriptional reprogramming during the passion fruit-Xap interaction, which represents an important step for a better understanding of this pathosystem.