Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo64_1.pdf: 5203988 bytes, checksum: 2716f553a36cd79192020095b593be96 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Danos provocados por estresses bióticos e/ou abióticos são fatores limitantes na produção do feijão-caupi (Vigna unguiculata), favorecendo a redução no crescimento e na produtividade desta cultura. Uma alternativa a estes fatores limitantes é o uso de cultivares com características genéticas competitivas e eficientes contribuindo para alcançar um padrão de agricultura mais sustentável e com melhores condições de produção. Assim, pesquisas que possibilitem compreender funções específicas de genes preditos de plantas e seus perfis de expressão em resposta a uma dada condição, são de extrema importância. Com base nisso, uma das metas do projeto NordEST (http://www.vigna.ufpe.br) consistiu na análise funcional de genes de feijão-caupi associados a estes tipos de estresses. Neste âmbito, o presente trabalho teve como objetivo analisar o perfil de expressão diferencial de genes através da técnica de SuperSAGE a partir de transcritos de folhas de feijão-caupi submetidas a injúria mecânica (biblioteca C2) e ao estresse causado pelo vírus do mosaico severo do feijãocaupi (CPSMV) (biblioteca BRM), com o intuito de obter um melhor entendimento com relação à resposta específica a este tipo de estresse, comparativamente a um controle negativo (ausência de injúria; biblioteca C1). As tags que apresentaram 100% de identidade com sequências de EST do banco privado de Vigna (banco NordEST), foram analisadas quanto à sua expressão diferencial e os transcritos que tiveram seus genes superexpressados e/ou reprimidos, dentro dos parâmetros requeridos (escore ≥42) foram anotados em categorias funcionais, de acordo com os termos de ontologia gênica (Gene Ontology) relativos a processos biológicos, função molecular e componente celular. Os resultados demonstraram que muitas sequências, tanto das bibliotecas submetidas à injúria, quanto as bibliotecas inoculadas com CPSMV estão relacionadas à categorias associadas a estresse, seguido de categorias relacionadas ao processos de tradução, ligação de proteínas, regulação da transcrição, redução de oxidação, transporte, proteólise, entre outros. Estas categorias estão relacionadas a rotas metabólicas importantes na resposta a estresses bióticos, indicando que estas tags representam um potencial real para descobertas de novos genes responsivos à injúria ou à resistência ao CPSMV, talvez ainda não descritos e/ou caracterizados

É conhecido que muitos softwares deixam de ser utilizados por sua complexa usabilidade. Mesmo ferramentas conhecidas por sua qualidade na execução de uma tarefa são abandonadas em favor de ferramentas mais simples de usar, de instalar ou mais rápidas. Na área da anotação funcional a ferramenta Sifter (v2.0) é considerada uma das com melhor qualidade de anotação. Recentemente ela foi considerada uma das melhores ferramentas de anotação funcional segundo o Critical Assessment of protein Function Annotation (CAFA) experiment. Apesar disso, ela ainda não é amplamente utilizada, provavelmente por questões de usabilidade e adequação do framework à larga escala. O workflow SIFTER original consiste em duas etapas principais: A recuperação das anotações para uma lista de genes e a geração de uma árvore de genes reconciliada para a mesma lista. Em seguida, a partir da árvore de genes o Sifter constrói uma rede bayesiana de mesma estrutura nas quais as folhas representam os genes. As anotações funcionais dos genes conhecidos são associadas a estas folhas e em seguida as anotações são propagadas probabilisticamente ao longo da rede bayesiana até as folhas sem informação a priori. Ao fim do processo é gerada para cada gene de função desconhecida uma lista de funções putativas do tipo Gene Ontology e suas probabilidades de ocorrência. O principal objetivo deste trabalho é aperfeiçoar o código-fonte original para melhor desempenho, potencialmente permitindo que seja usado em escala genômica. Durante o estudo do workflow de pré-processamento dos dados encontramos oportunidades para aperfeiçoamento e visualizamos estratégias para abordá-las. Dentre as estratégias implementadas temos: O uso de threads paralelas; balanceamento de carga de processamento; algoritmos revisados para melhor aproveitamento de disco, memória e tempo de execução; adequação do código fonte ao uso de bancos de dados biológicos em formato utilizado atualmente; aumento da acessibilidade do usuário; expansão dos tipos de entrada aceitos; automatização do processo de reconciliação entre árvores de genes e espécies; processos de filtragem de seqüências para redução da dimensão da análise; e outras implementações menores. Com isto conquistamos aumento de performance de até 87 vezes para a recuperação de anotações e 73,3% para a reconstrução da árvore de genes em máquinas quad-core, e redução significante de consumo de memória na fase de realinhamento. O resultado desta implementação é apresentado como Sifter-T (Sifter otimizado para Throughput), uma ferramenta open source de melhor usabilidade, velocidade e qualidade de anotação em relação à implementação original do workflow de Sifter. Sifter-T foi escrito de forma modular em linguagem de programação Python; foi elaborado para simplificar a tarefa de anotação de genomas e proteomas completos; e os resultados são apresentados de forma a facilitar o trabalho do pesquisador. / It is known that many software are no longer used due to their complex usability. Even tools known for their task execution quality are abandoned in favour of faster tools, simpler to use or install. In the functional annotation field, Sifter (v2.0) is regarded as one of the best when it comes to annotation quality. Recently it has been considered one of the best tools for functional annotation according to the \"Critical Assessment of Protein Function Annotation (CAFA) experiment. Nevertheless, it is still not widely used, probably due to issues with usability and suitability of the framework to a high throughput scale. The original workflow SIFTER consists of two main steps: The annotation recovery for a list of genes and the reconciled gene tree generation for the same list. Next, based on the gene tree, Sifter builds a Bayesian network structure in which its leaves represent genes. The known functional annotations are associated to the aforementioned leaves, and then the annotations are probabilistically propagated along the Bayesian network to the leaves without a priori information. At the end of the process, a list of Gene Ontology functions and their occurrence probabilities is generated for each unknown function gene. This work main goal is to optimize the original source code for better performance, potentially allowing it to be used in a genome-wide scale. Studying the pre-processing workflow we found opportunities for improvement and envisioned strategies to address them. Among the implemented strategies we have: The use of parallel threads; CPU load balancing, revised algorithms for best utilization of disk access, memory usage and runtime; source code adaptation to currently used biological databases; improved user accessibility; input types increase; automatic gene and species tree reconciliation process; sequence filtering to reduce analysis dimension, and other minor implementations. With these implementations we achieved great performance speed-ups. For example, we obtained 87-fold performance increase in the annotation recovering module and 72.3% speed increase in the gene tree generation module using quad-core machines. Additionally, significant memory usage decrease during the realignment phase was obtained. This implementation is presented as Sifter-T (Sifter Throughput-optimized), an open source tool with better usability, performance and annotation quality when compared to the Sifter\'s original workflow implementation. Sifter-T was written in a modular fashion using Python programming language; it is designed to simplify complete genomes and proteomes annotation tasks and the outputs are presented in order to make the researcher\'s work easier.

É conhecido que muitos softwares deixam de ser utilizados por sua complexa usabilidade. Mesmo ferramentas conhecidas por sua qualidade na execução de uma tarefa são abandonadas em favor de ferramentas mais simples de usar, de instalar ou mais rápidas. Na área da anotação funcional a ferramenta Sifter (v2.0) é considerada uma das com melhor qualidade de anotação. Recentemente ela foi considerada uma das melhores ferramentas de anotação funcional segundo o Critical Assessment of protein Function Annotation (CAFA) experiment. Apesar disso, ela ainda não é amplamente utilizada, provavelmente por questões de usabilidade e adequação do framework à larga escala. O workflow SIFTER original consiste em duas etapas principais: A recuperação das anotações para uma lista de genes e a geração de uma árvore de genes reconciliada para a mesma lista. Em seguida, a partir da árvore de genes o Sifter constrói uma rede bayesiana de mesma estrutura nas quais as folhas representam os genes. As anotações funcionais dos genes conhecidos são associadas a estas folhas e em seguida as anotações são propagadas probabilisticamente ao longo da rede bayesiana até as folhas sem informação a priori. Ao fim do processo é gerada para cada gene de função desconhecida uma lista de funções putativas do tipo Gene Ontology e suas probabilidades de ocorrência. O principal objetivo deste trabalho é aperfeiçoar o código-fonte original para melhor desempenho, potencialmente permitindo que seja usado em escala genômica. Durante o estudo do workflow de pré-processamento dos dados encontramos oportunidades para aperfeiçoamento e visualizamos estratégias para abordá-las. Dentre as estratégias implementadas temos: O uso de threads paralelas; balanceamento de carga de processamento; algoritmos revisados para melhor aproveitamento de disco, memória e tempo de execução; adequação do código fonte ao uso de bancos de dados biológicos em formato utilizado atualmente; aumento da acessibilidade do usuário; expansão dos tipos de entrada aceitos; automatização do processo de reconciliação entre árvores de genes e espécies; processos de filtragem de seqüências para redução da dimensão da análise; e outras implementações menores. Com isto conquistamos aumento de performance de até 87 vezes para a recuperação de anotações e 73,3% para a reconstrução da árvore de genes em máquinas quad-core, e redução significante de consumo de memória na fase de realinhamento. O resultado desta implementação é apresentado como Sifter-T (Sifter otimizado para Throughput), uma ferramenta open source de melhor usabilidade, velocidade e qualidade de anotação em relação à implementação original do workflow de Sifter. Sifter-T foi escrito de forma modular em linguagem de programação Python; foi elaborado para simplificar a tarefa de anotação de genomas e proteomas completos; e os resultados são apresentados de forma a facilitar o trabalho do pesquisador. / It is known that many software are no longer used due to their complex usability. Even tools known for their task execution quality are abandoned in favour of faster tools, simpler to use or install. In the functional annotation field, Sifter (v2.0) is regarded as one of the best when it comes to annotation quality. Recently it has been considered one of the best tools for functional annotation according to the \"Critical Assessment of Protein Function Annotation (CAFA) experiment. Nevertheless, it is still not widely used, probably due to issues with usability and suitability of the framework to a high throughput scale. The original workflow SIFTER consists of two main steps: The annotation recovery for a list of genes and the reconciled gene tree generation for the same list. Next, based on the gene tree, Sifter builds a Bayesian network structure in which its leaves represent genes. The known functional annotations are associated to the aforementioned leaves, and then the annotations are probabilistically propagated along the Bayesian network to the leaves without a priori information. At the end of the process, a list of Gene Ontology functions and their occurrence probabilities is generated for each unknown function gene. This work main goal is to optimize the original source code for better performance, potentially allowing it to be used in a genome-wide scale. Studying the pre-processing workflow we found opportunities for improvement and envisioned strategies to address them. Among the implemented strategies we have: The use of parallel threads; CPU load balancing, revised algorithms for best utilization of disk access, memory usage and runtime; source code adaptation to currently used biological databases; improved user accessibility; input types increase; automatic gene and species tree reconciliation process; sequence filtering to reduce analysis dimension, and other minor implementations. With these implementations we achieved great performance speed-ups. For example, we obtained 87-fold performance increase in the annotation recovering module and 72.3% speed increase in the gene tree generation module using quad-core machines. Additionally, significant memory usage decrease during the realignment phase was obtained. This implementation is presented as Sifter-T (Sifter Throughput-optimized), an open source tool with better usability, performance and annotation quality when compared to the Sifter\'s original workflow implementation. Sifter-T was written in a modular fashion using Python programming language; it is designed to simplify complete genomes and proteomes annotation tasks and the outputs are presented in order to make the researcher\'s work easier.

Plasmodium vivax é o parasita causador de malária humana com maior distribuição global, responsável pela redução da qualidade de vida de milhões de pessoas ao redor do mundo. O objetivo geral do trabalho foi contribuir, através de metodologias estatísticas e de bioinformática, para o entendimento do mecanismo de escape da eliminação pelo baço do hospedeiro utilizado por P. vivax. Para isso, primeiramente realizou-se a análise estatística de um experimento de transcritômica, através de microarrays. Esse experimento foi conduzido previamente pelo grupo de colaboradores do presente estudo, utilizando um modelo animal, Aotus lemurinus griseimembra, com o objetivo de identificar genes de P. vivax expressos somente em parasitas retirados de macacos que possuíam o baço intacto. Em uma segunda fase, foi projetado um tiling array contendo todos os éxons e as regiões 5UTR e 3UTR disponíveis do genoma de P. vivax, que será utilizado para a realização de mais investigações a respeito da influência da presença do baço na expressão gênica de P. vivax. Na última etapa, foi conduzida uma melhoria na anotação funcional do genoma de P. vivax, através de uma metodologia automática, com o objetivo de adicionar informações para auxiliar na interpretação biológica dos resultados obtidos anteriormente e em estudos futuros. / Plasmodium vivax is the parasite that causes the human malaria type with the largest global distribution and it is responsible for quality of life impairment of millions of people around the world. The general purpose of this study was contribute to understand the mechanism used by P. vivax to scape from the host spleen elimination, through statistical methodologies and bioinformatics. First of all, we carried out statistical analysis of a microarray experiment conducted earlier by the collaborators of this study, using Aotus lemurinus griseimembra as model organism, in order to identify genes of P. vivax expressed only in parasites extracted from monkeys with intact spleen. In the second step, we designed a tiling array containing 5\'UTR, 3\'UTR and all the exons of the P. vivax genome, which will be used to perform more experiments to investigate the role of the spleen on the parasite gene expression. In the last step, we add information to the functional annotation of P. vivax genome, through an automated methodology, to improve the biological interpretation of the results previously obtained and in future studies.

Plasmodium vivax é o parasita causador de malária humana com maior distribuição global, responsável pela redução da qualidade de vida de milhões de pessoas ao redor do mundo. O objetivo geral do trabalho foi contribuir, através de metodologias estatísticas e de bioinformática, para o entendimento do mecanismo de escape da eliminação pelo baço do hospedeiro utilizado por P. vivax. Para isso, primeiramente realizou-se a análise estatística de um experimento de transcritômica, através de microarrays. Esse experimento foi conduzido previamente pelo grupo de colaboradores do presente estudo, utilizando um modelo animal, Aotus lemurinus griseimembra, com o objetivo de identificar genes de P. vivax expressos somente em parasitas retirados de macacos que possuíam o baço intacto. Em uma segunda fase, foi projetado um tiling array contendo todos os éxons e as regiões 5UTR e 3UTR disponíveis do genoma de P. vivax, que será utilizado para a realização de mais investigações a respeito da influência da presença do baço na expressão gênica de P. vivax. Na última etapa, foi conduzida uma melhoria na anotação funcional do genoma de P. vivax, através de uma metodologia automática, com o objetivo de adicionar informações para auxiliar na interpretação biológica dos resultados obtidos anteriormente e em estudos futuros. / Plasmodium vivax is the parasite that causes the human malaria type with the largest global distribution and it is responsible for quality of life impairment of millions of people around the world. The general purpose of this study was contribute to understand the mechanism used by P. vivax to scape from the host spleen elimination, through statistical methodologies and bioinformatics. First of all, we carried out statistical analysis of a microarray experiment conducted earlier by the collaborators of this study, using Aotus lemurinus griseimembra as model organism, in order to identify genes of P. vivax expressed only in parasites extracted from monkeys with intact spleen. In the second step, we designed a tiling array containing 5\'UTR, 3\'UTR and all the exons of the P. vivax genome, which will be used to perform more experiments to investigate the role of the spleen on the parasite gene expression. In the last step, we add information to the functional annotation of P. vivax genome, through an automated methodology, to improve the biological interpretation of the results previously obtained and in future studies.

A identificação de genes alvos, vias de sinalização e vias metabólicas para melhoramento de cana-de-açúcar associados a características de interesse, ainda são pouco conhecidos e estudados. Alguns estudos do transcriptoma através de plataformas de microarranjo têm buscado identificar listas de genes, para experimentos tecido- específico ou submetidos a condições de estresse bióticos e abióticos. Estudos pontuais destes dados tem sido associados a vias metabólicas ou vias de sinalização já descritas na literatura, de forma a identificar alterações relacionadas a padrões de expressão gênica. Porém, estas relações em cana-de-açúcar são pouco conhecidas e estudadas. O estudo e entendimento de cana-de-açúcar por meio da diversidade genética e de sua adaptação ao ambiente é um grande desafio, principalmente pela ausência de um genoma sequenciado e por possuir um genoma complexo. Apresentamos nossos resultados para tentar superar tais limitações e desafios para estudos de expressão gênica. Foram desenvolvidas metodologias para anotação funcional do transcriptoma, centradas na transferência de anotação, identificação de vias metabólicas e enzimas pelo método de similaridade bi-direcional, predição de genes full-length, análises de ortologia e desenho de oligonucleotídeos para microarranjos customizados, resultando no ORFeoma de cana-de-açúcar, na identificação e classificação de famílias de fatores de transcrição e identificação de genes ortólogos entre gramíneas. Além disso, desenvolvemos uma plataforma para processamento e análise automatizada de experimentos por microarranjo, para armazenamento, recuperação e integração com a anotação funcional. Adicionalmente desenvolvemos e implementamos métodos para seleção de genes diferencialmente e significativamente expressos, e abordagens para análise de enriquecimento de categorias, e escores de atividade de vias metabólicas. De forma a integrar a anotação funcional do transcriptoma aos estudos por expressão gênica, desenvolvemos a plataforma CaneRegNet e uma interface para integração desta rede de dados biológicos e conhecimentos, composta por aplicativos para consulta e prospecção de dados por análises de agrupamento e correlação entre experimentos de microarranjo, possibilitando a geração de novas hipóteses e predições dentro da organização da regulação celular. / The identification of target genes, metabolic and signaling pathways associated with characteristics of interest to the sugarcane improvement are still poorly known and studied. Some transcritptome studies through microarray platforms has tried to identify lists of genes, for tissue-specific experiments or subjected to conditions of biotic and abiotic stress. In the literature specific studies of these data has already been associated with metabolic or signaling pathway, in order to identify changes in these tracks related to patterns of gene expression. However, these relations are still little know and generally defined slightly. The study and understanding of sugarcane by means of genetic diversity and its adaptation to the environment is a major challenge, mainly due to the absence of a sequenced genome and by your complex genome. We present our results to surpass this barrier e challenges for the study of gene expression. Methodologies were developed for the transcriptome functional annotation, focused on the annotation transfer, identification of metabolic pathways and enzymes by the bi- directional method; prediction of full-length genes; ortology analysis and probe design for customized microarrays, resulting in the sugarcane ORFeome, the identification and classification of transcription factor families and identification of ortholog genes between grasses. Besides that, we have developed a plataform for automated processing and analysis for microarray experiments, to store, retrieve and integration with the functional annotation. Additionally, we have developed and implemented methods for identification of differentially and significantly expressed genes, and approaches for over-represented analysis and functional class scoring (FCS). To integrate the functional annotation and the studies by gene expression profile, we have developed the CaneRegNet platform and an interface to integrate this network of biological data and knowledge, composed by searching and data mining tools for clustering and correlations between microarray experiments, enabling the generation of new hypothesis and predictions around the organization of cellular regulation.

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

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In the first year, corresponding to Article 1, the transcripts from leaf samples were sequenced by RNA-seq, and in the second year, corresponding to Article 2, the transcripts from leaf and root samples were sequenced, for both cultivars, under normal and limited irrigation during the reproductive phase. In Article 1, the sequencing showed in Douradão 27,618 transcripts, from which 24,090 (87.2 %) showed homology to rice genes and 27,221 transcripts in Primavera, from which 23,663 (86.9 %) showed homology to rice genes. Douradão had 493 diferentially expressed genes (DEGs) and Primavera 1,154 DGEs. In Article 2 it were identified 44,978 and 37,898 transcripts in leaf and root tissues, respectively. Douradão showed 3,554 and 840 diferentially expressed genes (DEGs), in leaf and root tissues, respectively, while Primavera showed 1,141 and 1,975 DEGs on those tissues, respectively.It were identified genes from different metabolic routes related to distinct drought tolerance mechanisms in leaf and root tissues, such as cell signaling -related genes, transcription factors, functional protective proteins and cell cellular detoxification enzymes. A set of expressed genes from both tissues were validated by RT–qPCR and most of them were similar to the results of RNA-seq results. The rice transcripts not annotated were submitted to an orthology analysis in relation to the Arabidopsis thaliana databank, which revealed one gene related to the root cell growth Douradão. The 16 genes validated by RT-qPCR will be used as molecular markers for marker assisted selection in the upland rice breeding program and are candidate genes for use in transformation of rice cultivars susceptible to drought. / O arroz de terras altas é sensível à seca principalmente durante a fase reprodutiva, quando até mesmo o estresse moderado pode resultar na redução drástica de produtividade. Diante da seca uma variedade de genes é induzida nas plantas, desencadeando uma complexa rede de respostas que se estende desde a percepção e reconhecimento do sinal de estresse até a ativação de genes de resposta adaptativa. O objetivo desta tese foi estudar o transcriptoma de duas cultivares brasileiras de arroz de terras altas (Douradão e Primavera), constrastantes em relação à tolerância à seca, e submetidas a dois experimentos sob déficit hídrico em dois anos consecutivos. No primeiro ano, correspondente ao Artigo 1, foram sequenciados os transcritos provenientes de amostras de folhas, e no segundo ano, correspondente ao Artigo 2, foram sequenciados os transcritos provenientes de amostras de folhas e raízes, para as duas cultivares, sob condições normais e restritas de irrigação durante a fase reprodutiva das plantas. No Artigo 1, o sequenciamento revelou 27.618 transcritos em Douradão, com 24.090 (87,2%) de homologia à genes de arroz e 27.221 transcritos na cultivar Primavera, dos quais 23.663 (86,9%) apresentaram homologia aos genes de arroz. Douradão apresentou 493 genes diferencialmente expressos (GDEs) e Primavera 1.154 GDEs. No Artigo 2 foram identificados 44.978 transcritos do tecido foliar e 37.898 transcritos do tecido radicular, considerando o número total de transcritos de ambas as cultivares. Douradão apresentou 3.554 e 840 GDEs, respectivamente, no tecido foliar e radicular, enquanto que Primavera apresentou, 1.141 e 1.975 GDEs. Foram identificados vários genes atuantes em rotas metabólicas envolvidas em diferentes mecanismos de tolerância a seca nos tecidos foliar e radicular, como por exemplo, genes relacionados à sinalização celular, fatores de transcrição, proteínas protetoras funcionais da célula e enzimas de detoxificação celular. Um conjunto de genes expressos em ambos os tecidos foram validados via RT-qPCR e a maioria deles tiveram resultados similares aos resultados de RNA-seq. Foi realizada uma análise de ortologia envolvendo os transcritos não anotados em arroz contra o banco de dados de Arabidopsis thaliana, a qual revelou um gene relacionado ao crescimento celular de raízes na cultivar Douradão. Os 16 genes validados via RT-qPCR relacionados a tolerância à seca serão utilizados como marcadores moleculares em seleção assistida no programa de melhoramento de arroz de terras altas e são genes candidatos a serem utilizados na transformação de genótipos sensíveis à seca.

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

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Muito usada pela medicina popular para o tratamento de problemas gastrointestinais e respiratórios, a folha desta espécie produz um óleo essencial rico em terpenos, principalmente mono e sesquiterpenos. Estes compostos não são apenas de interesse farmacológico, como também industrial. A composição deste óleo pode variar em função de fatores abióticos e também de variações genotípicas. Diante da complexidade da síntese destes compostos a proposta deste trabalho foi uma ampla caracterização do transcriptoma de folha de Lippia alba, além da identificação de prováveis enzimas envolvidas na síntese de terpenos. Para isso, foi feito um sequenciamento deste transcriptoma usando a plataforma 454 (Roche) seguido de uma montagem de novo. Esta plataforma tem sido cada vez mais utilizada para o sequenciamento de transcriptomas numa abordagem conhecida como RNA-Seq. O sequenciamento de biblioteca preparada a partir de RNA total em 1/8 de placa gerou 104.631 leituras com comprimento médio de 184,48bp num total de 19.302.161 bases. Foram feitas montagens das leituras usando 2 diferentes assemblers a fim de compará-las. Com o Newbler 2.5 foi possível montar 2.686 contigs com comprimento médio de 349bp, enquanto o SeqMan2.2 gerou 13.448 contigs com média de 284bp. Em seguida, foi feita a anotação funcional com o Blast2GO para os contigs obtidos nas duas montagens, tendo sido anotados 51,49% e 30,88%, respectivamente, dos contigs do Newbler e do SeqMan. Por fim, a análise das sequências anotadas revelou algumas enzimas potencialmente envolvidas com a síntese de terpenos. Os resultados obtidos neste estudo pioneiro sobre a espécie comprovam que as tecnologias NGS podem ser uma ferramenta bastante eficiente para o sequenciamento de transcriptomas e servirão como referência para o preparo mais específico de novas bibliotecas. Futuros sequenciamentos devem contribuir para uma melhor cobertura do transcriptoma permitindo a descoberta inclusive de transcritos raros. / Lippia alba, popularly known as erva cidreira, is widely distributed throughout the Americas and can be found through almost whole Brazil. This species is largely used in folk medicine to treat gastrointestinal and respiratory problems, especially leaves, which produce an essential oil rich in terpenes, mainly mono-and sesquiterpenes. These compounds are not only of pharmacological interest, as well as industrial. Composition of essencial oil can vary depending on the developmental stage, the plant part and other abiotic factors. However, genotypic variations also contribute to oil composition variation. Given the complexity of terpenes synthesis, including diversity of enzymes involved in these metabolic pathways, the purpose of this work was a L. alba leaf transcriptome characterization, in addition to identifying some enzymes probably involved in terpene synthesis. For that, it was made a transcriptome sequencing using 454 platform (Roche) followed by a de novo assembly. This platform, along with other NGS technologies, has been increasingly used for transcriptome sequencing in an approach known as RNA-Seq. Sequencing of a library prepared from total RNA in 1/8 plate generated 104,631 reads with average length of 184.48 bp and a total of 19,302,161 bases. Read assemblies were made using two different assemblers in order to compare them. While Newbler 2.5, proprietary software platform, assembled 2686 contigs with average length of 349bp, SeqMan2.2 generated 13,448 contigs with an average of 284bp. Then, functional annotation was performed with Blast2GO for all contigs from both assemblies; 51.49% and 30.88% of contigs, respectively, from Newbler and SeqMan were annotated. Finally, analysis of annotated sequences revealed some enzymes potentially involved in terpene synthesis. Results obtained from this pioneering study on the species show that NGS technology can be a very efficient tool for transcriptome sequencing and they will serve as reference for preparation of other more specific libraries. New sequencings should contribute to a better coverage of this transcriptome, allowing discovery of even rare transcripts.