Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-20T12:12:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_SylvioAndreGarciaVieira.pdf: 3455615 bytes, checksum: 2826b01774c4732fb20d76dd1dde7a09 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-20T12:12:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_SylvioAndreGarciaVieira.pdf: 3455615 bytes, checksum: 2826b01774c4732fb20d76dd1dde7a09 (MD5) Previous issue date: 2016-08-23 / The analysis of the biological formations through computer programs has been turning the interpretation of information quicker, more practical, and more reliable. There are a great number of data stored in specialized databases all over the world, that need to be analyzed and interpreted. On the biological databases, there are data obtained from a variety of ways of research in organisms affected by illnesses such as adenoma and carcinoma. There are also data related to the processes of maintenance of the organism in various levels, called pathways. These pathways act in the organism in a different way in every stage, such as in its normality or in the presence of some genetic disease. This study aims at using graphs in order to develop a model of pathway interaction network that incorporate the maintenance of the genome and other activities of the organism conveyed in adenoma and carcinoma of the adrenal cortex, identifying those who are active in the organism in the presence of gene mutation. In order to determine which pathways are modified in the presence of each disease was used a calculus of relative activity of the route associated to the statistical test Z. To visualize the results, graphs were used, whose junctions represent the pathways and whose edges represent the interactions. Through the computer program developed, it was possible to identify the differences that the organism presents in these conditions, allowing the suggestion of employment of this technique to identify modifications that the organism may present when a new nanoencapsulated drug is used. / A análise de informações biológicas por meios computacionais vem tornando as atividades de interpretação das informações mais rápida, prática e confiável. Existem muitos dados depositados em bancos especializados ao redor do mundo, que precisam ser avaliados e interpretados. Nestes bancos de dados de informações biológicas há informações resultantes de várias formas de pesquisas em organismos acometidos de doenças, como adenomas e carcinomas. A evolução dessas doenças ocorre através da ativação de vias muito específicas. Estas vias atuam no organismo de forma diferente em cada estado, como na sua normalidade ou na presença de alguma doença genética. Este trabalho tem por objetivo utilizar grafos para desenvolver um modelo de redes de interação de vias que envolvam a manutenção do genoma e outras atividades do organismo expressas em adenoma e carcinoma de córtex adrenal, identificando as vias expressas no organismo na presença de mutações. Para determinar quais vias estariam com a sua expressão alterada na presença de cada doença, foi utilizado o cálculo de atividade relativa da via associado ao teste estatístico Z. Para visualização dos resultados foram utilizados grafos, cujos nós representam as vias e as arestas representam as interações. Por meio do sistema computacional desenvolvido foi possível identificar as diferenças que o organismo apresenta nestas condições, permitido a sugestão de utilização desta técnica para a identificação das modificações que o organismo possa apresentar quando da utilização de um novo fármaco nanoencapsulado.

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T13:52:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alborghetti_MarcosRodrigo_D.pdf: 16630969 bytes, checksum: 42e040f25194010a25828aeaa31ac3c2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As proteínas humanas FEZ1 e FEZ2 (fasciculation and elongation protein zeta) são ortólogas da proteína UNC-76 de C. elegans e estão envolvidas no crescimento e na fasciculação dos axônios através de interações que envolvem kinesinas, mitocôndrias e vesículas sinápticas. Além disso, algumas evidências sugerem a participação de FEZ1 na etiologia da esquizofrenia, no ciclo viral, além da resistência à quimioterápicos. Sua estrutura intrinsecamente desordenada, com coiled-coil ao longo da sequência, pode contribuir para sua função. Nós exploramos a evolução molecular da família de proteínas FEZ com ênfase no ramo dos vertebrados. Através do perfil do interactoma comparado entre FEZ1 e FEZ2 de Homo sapiens e UNC-76 de C. elegans foi observado um padrão de conservação das interações proteínaproteína entre FEZ1 e UNC-76, que explicam a capacidade de FEZ1 resgatar os defeitos causados por mutações em unc-76 em nematoides, de acordo com o descrito por Bloom e colaboradores em 1997. Além disso, caracterizamos a interação entre FEZ1 e SCOCO (short coil-coiled) por SAXS (Small Angle X-ray Scattering). Essa interação já foi descrita previamente entre os seus ortólogos UNC-76 e UNC-69, que cooperam no crescimento axonal. Um estado de heterotetramérico foi observado, consistindo de duas moléculas GST-SCOCO interagindo com duas moléculas de 6xHis-FEZ1 dimerizadas. Por PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis, eletroforese em gel de poli-acrilamida), SAXS, Espectrometria de Massas e Ressonância Magnética Nuclear, constatamos que FEZ1 dimeriza envolvendo a formação de ponte dissulfeto. In vivo, este estado dimérico de forma covalente pode ser importante para o transporte mediado por kinesinas de proteínas ao longo dos microtúbulos. Assim, FEZ1 pode ser classificada como uma proteína adaptadora do transporte, dimérica e bivalente, essencial para o crescimento axonal e organização pré-sináptica normal e transporte de cargas. A agregação de novos parceiros de interação encontrada para a proteína FEZ2 poderia ser interpretada como aquisição de novas funções moleculares e pode ter ocorrido nos primeiros estágios da evolução dos cordados / Abstract: The human proteins FEZ1 and FEZ2 (fasciculation and elongation protein zeta 1) are orthologs of the protein UNC-76 from C. elegans, involved in growth and fasciculation of axons, through interactions that involve kinesins, mitochondria and synaptic vesicles. Moreover, some evidence suggests involvement of FEZ1 in the etiology of schizophrenia, in addition to the viral cycle and resistance to chemotherapy. Its structure intrinsically disordered, with coiled-coil along the sequence, can contribute to its function. We have explored the molecular evolution of the FEZ protein family with emphasis on the vertebrata branch. Analyzing the interactome profile of the FEZ1 and FEZ2 from Homo sapiens and UNC-76 from C. elegans we observed a conserved pattern of protein-protein interactions among FEZ1 and UNC-76 that explain the ability of FEZ1 to rescue the defects caused by unc-76 mutations in nematodes, according to Bloom and co-workers in 1997. Furthermore, we characterized the interaction between FEZ1 and SCOCO (short coiled-coil protein) by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). This interaction has been previously reported between their orthologs UNC-76 and UNC-69 that cooperate in axonal outgrowth. A heterotetrameric state was observed, which consists of two GST-SCOCO molecules attached to two FEZ1 molecules. By PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), SAXS, Mass Spectrometry and Nuclear Magnetic Resonance we defined that FEZ1 dimerizes involving formation of disulfide bond. In vivo this covalent mediated dimeric state could be important for kinesin mediated protein transport along the microtubule. Thereby, FEZ1 may be classified as a dimeric and bivalent transport adaptor, essential to axon outgrowth and normal pre-synaptic organization and transport of cargoes. The aggregation of new interaction partners found for the FEZ2 protein could be interpreted as the acquisition of new molecular functions and may have occurred in the early stages of chordate evolution / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:15:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Basei_FernandaLuisa_D.pdf: 43645148 bytes, checksum: 4cb7da11417bc57aea32c2db81dddc18 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As Neks são proteínas quinases similares a NIMA, proteína que é indispensável para a entrada em mitose de células de Aspergillus nidulans. Em humanos foram identificadas 11 Neks (1-11) e, estudos crescentes vêm demonstrando a participação destas em diversas funções celulares além do controle do ciclo e divisão celular. A Nek4 é um dos maiores membros dessa família e sua relação com a manutenção ciliar e resposta ao DNA danificado já foi demonstrada. Contudo, seus parceiros de interação e substratos são ainda desconhecidos. Para melhor compreender o papel da Nek4 foi realizado um estudo de interatoma para identificar novos processos biológicos com os quais a Nek4 está envolvida. Inicialmente foi identificada uma nova isoforma para a Nek4 e assim, realizou-se o estudo de interatoma para as duas isoformas com a finalidade de comparar o perfil de interação das duas proteínas. As duas isoformas da Nek4 foram expressas em células humanas e após imunoprecipitação seguida de identificação por espectrometria de massas, foram identificadas 474 proteínas que interagem com a isoforma 1 da Nek4, Nek4.1 e 149 para a isoforma 2, Nek4.2. Dentre as proteínas identificadas, 102 interagem com ambas isoformas da Nek4. Nossos resultados confirmam o envolvimento da Nek4 com a resposta ao DNA danificado, função ciliar, estabilização dos microtúbulos e ainda sugerem o envolvimento da Nek4 em funções completamente novas, como processamento de RNAm, resposta ao estresse, controle de qualidade das proteínas e apoptose. Entre os parceiros de interação encontramos importantes proteínas como TRAP-1, Whirlin, PCNA, 14-3-3?, Btf, PARP-1, SRSF1, PAI-RBP1 e KAP-1. As duas isoformas compartilham funções que não foram ainda descritas para os membros da família Nek e a isoforma 1 ainda apresenta funções que já foram descritas para outros membros da família. Aliado ao resultado da imunoprecipitação ainda foram realizadas imunofluorescências que permitiram verificar a localização da Nek4 em diferentes estruturas celulares, como os speckles nucleares e a mitocôndria, corroborando com a função no processamento de RNAm e apoptose. O experimento de imunoprecipitação seguido de identificação por espectrometria de massas também apontou para a possibilidade de autofosforilação e dimerização da Nek4. Além disso, foi possível observar diferenças entre o perfil de interação das duas isoformas da Nek4, sendo que a isoforma 1 interage com proteínas que mantém funções biológicas similares a outras Neks, que a isoforma 2 não apresenta / Abstract: Neks are serine-threonine kinases that are similar to NIMA, a protein found in Aspergillus nidulans which is essential for cell division. In humans there are eleven Neks (1-11) which are involved in different biological functions besides the cell cycle control. Nek4 is one of largest members of the Neks family and has been related to the primary cilia formation and in DNA damage response. However, its substrates and interaction partners are still unknown. Thus in an attempt to better understand the role of Nek4 we performed an interactomics study to find new biological processes in which Nek4 is involved. Besides, we described here a novel Nek4 isoform and compared the interactomics profile of these two Nek4 proteins. Isoform 1 and isoform 2 of Nek4 were expressed in human cells and after an immunoprecipitation followed by mass spectrometry, 474 interacting proteins were identified for isoform 1 and 149 for isoform 2 of Nek4. 102 proteins are common interactors between both isoforms. Our results confirm Nek4 involvement in the DNA damage response, cilia maintenance and microtubules stabilization, and raise the possibility of new functional contexts including mRNA processing, apoptosis signaling, stress response, translation and protein quality control. Among the interaction partners, we found important proteins such as TRAP-1, Whirlin, PCNA, 14-3-3?, Btf, PARP-1, SRSF1, PAI-RBP1 and KAP-1. We could observe that both isoforms share functions that are new to the Nek family, and isoform 1 apparently has also maintained functions which have already been established to other Nek family members. From our immunoprecipitation followed by mass spectrometry experiment a possible site for Nek4 autophosphorylation and dimerization was identified. This study provides new insights into Nek4 functions, identifying new interaction partners, localization to new cellular compartment and further suggests an interesting difference between isoform 1 and the novel isoform 2 of Nek4. Nek4 isoform 1 may have maintained similar roles compared to other Neks and these roles are not related to isoform 2 / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:22:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cordeiro_IsabelleBezerra_D.pdf: 17466566 bytes, checksum: de71f83d2b4d3c8e0f0269f5d61d332d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A proteína Focal Adhesion Kinase (FAK; PTK2) participa de vários processos celulares. A identificação das proteínas parceiras de FAK tem contribuído para o entendimento de suas múltiplas funções celulares. Utilizando um sistema de indução de FAK fusionada a uma cauda de FLAG, combinada com análises por espectrometria de massas (MS), identificamos proteínas associadas à FAK em células HEK293. Um total de 153 proteínas foram repetidamente identificadas com alta resolução por experimentos de MS. Além de confirmar interações já previamente descritas como Paxillin (PXN), Heat shock protein Hsp90 (HSP90) e Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein (TGF?1I1), as análises por MS revelaram um novo conjunto de proteínas associadas à FAK, incluindo proteínas envolvidas nas vias de síntese de proteínas, expressão gênica, crescimento celular, proliferação, morte e sobrevivência celular. Além disso, análises de bioinformática das vias indicaram que a FAK se associa com um conjunto de 30 proteínas envolvidas com a via de modificação pós-transcricional do RNA, incluindo a proteína Serine/arginine-rich splicing factor 2 (SC-35; SRSF2), que é um marcador de speckles nucleares. Esse conjunto de proteínas está associado ao spliceossomo e um conjunto similar de proteínas também foi identificado com os experimentos que utilizaram somente o domínio FERM da FAK. Validações por Western Blotting e imunocitoquímica demonstraram que FAK se associa e co-localiza com a proteína SC-35 no núcleo celular. Ainda identificamos um papel funcional da FAK no splicing do mRNA. Demonstramos que FAK pode modificar o padrão de splicing de um gene repórter E1A ao ser superexpressa em células HEK. Nosso trabalho propõe novas funções da FAK no núcleo, indicando que esta pode estar envolvida em eventos relacionados à função do RNA, como a regulação do splicing do mRNA / Abstract: Focal adhesion kinase (FAK; PTK2) has roles in many cellular processes. The identification of protein partners for FAK has greatly contributed to our understanding of its multiple function. Using inducible FLAG-tagged FAK combined with affinity/purification mass spectrometry (MS) approach, we identified proteins associated with FAK in HEK293 cells. A total of 153 proteins were repeatedly detected in high-resolution MS measurements. Beyond the well characterized partnering with Paxillin (PXN), Heat Shock protein 90 (HSP90) and Transforming growth factor beta-1-induced transcript 1 protein (TGFB1I1), analysis of MS data uncovered novel sets of proteins that associate with FAK, playing a role in protein synthesis, gene expression, cellular growth, proliferation, death and survival. In addition, the network analysis established the unexpected finding that a module of 30 proteins linked to RNA post-transcriptional modifications are recruited by FAK, including Serine/arginine-rich splicing factor 2 (SC-35; SRSF2), which is a marker of the nuclear speckles. Indeed, this module is found to be enriched by proteins associated with spliceosome. Remarkably, a similar set of proteins was also recruited by FAK N-terminal FERM domain. Biochemical and imunofluorescence validations established that FAK associates and co-localizes with SC-35 protein at the cell nuclei. We further pinpoint a functional role of FAK in mRNA splicing. We showed that FAK can modify the splicing site selection of the adenoviral E1A minigene in a dose-dependent manner. Our work provides new insights into the molecular function of FAK in the nucleus, indicating that it may be involved in events related to RNA function, such as pre-mRNA splicing / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T15:15:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_EdmarciaElisa_D.pdf: 15682912 bytes, checksum: e58bfe67bbf5f3bc0979ec28db650292 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As proteínas Neks (NIMA-related kinases) representam uma família de 11 quinases humanas nomeadas Nek1 a 11 que compartilham 40 a 45% de identidade de sequência com o regulador mitótico NIMA identificado em Aspergillus nidulans. O sinergismo entre os mecanismos que dirigem a mitose é essencial para a adequada divisão celular e sua desregulação é correlacionada ao aparecimento de cânceres humanos. As Neks são essenciais para progressão do ciclo celular e por isso têm recebido especial atenção como alvos para terapia do câncer. A Nek7 humana, por sua vez, contribui para formação do fuso mitótico e biogênese dos centrossomos. Neste trabalho, nós revelamos a Nek7 como uma quinase multifuncional. Nossos estudos demonstraram um amplo espectro de proteínas de interações com a Nek7 humana, classificadas dentro de múltiplas categorias funcionais, sobretudo, da divisão celular. Alguns novos parceiros de interação também são seus potencias substratos e, ainda, localizam com a Nek7 em estruturas essenciais para a mitose e citocinese. Nós evidenciamos ainda, que através de mecanismos distintos, os domínios N- e C-terminal de Nek6 e Nek7 podem contribuir diferencialmente para a regulação e catálise e podem proporcionar a base estrutural para a independência funcional dessas quinases na sinalização celular. Além disso, usando estudos baseados microscopia confocal e RNAi (RNA interference), nós mostramos que o interactor de Nek7, a proteína RGS2, é necessária para organização e orientação do fuso mitótico. Células em metáfase suprimidas de RGS2 apresentaram fenótipos tais como: prisão na mitose; defeitos na tensão dos cinetocóros e alinhamento dos cromossomos; desorganização do fuso mitótico; perturbação na redistribuição de proteínas do polo do fuso envolvidas em nucleação; mal-orientação do fuso mitótico; e redução de microtúbulos dos ásteres e de dinâmica. Além disso, tanto a supressão quanto a superexpressão das formas selvagem e quinase dead de Nek7 prejudicaram o recutamento de ?-tubulina para o polo do fuso. Esses achados introduz a participação de RGS2 na mitose e indicam que esta pode atuar cooperativamente com Nek7 para a precisa organização e formação do fuso mitótico. Por fim, empregando biologia de sistemas, nós mostramos um compreensivo interactoma das Neks, destacando para um possível crosstalking de todos os membros da família nos processos de regulação de centríolos e mitose; função ciliar e ciliopatias; e resposta a dano de DNA / Abstract: The Neks (NIMA-related kinases) proteins represent a human kinases family named Nek1 to 11 that share 40 to 45% of sequence identity with the established NIMA mitotic regulator, identified in Aspergillus nidulans. The synergism of the mechanisms that drive mitosis is essential for proper cell division and its dysregulation is correlated with the occurrence of human cancers. The Neks are essential for cell cycle progression and therefore have received attention as targets for cancer therapy and other diseases. Human Nek7 contributes to mitotic spindle formation and centrosome biogenesis. Herein, we reveal Nek7 as a multifunctional kinase. Our proteomic studies have demonstrated a broad spectrum of interaction proteins of human Nek7 classified into multiple functional categories, especially, cell division. Some new interaction partners are also potential Nek7 substrates and localize in key structure during mitosis and cytokinesis. We also evidenced that, through different mechanisms, the N- and C- terminal domains of Nek7 and Nek6 can differentially contribute to the regulation and catalysis and provide the basis for a functional independence of Nek6 and Nek7 in cell signaling. Furthermore, using studies based in confocal microscopy and RNAi we showed the Nek7 interactor, RGS2 protein, is required for organization and orientation of the mitotic spindle. Metaphase cells RGS2-depleted showed phenotypes such as: arrest in mitosis; defects in tension kinetochores and alignment chromosomes; disruption of the mitotic spindle; disturbance in the proteins redistribution of the spindle pole involved in nucleation and microtubule dynamics; mitotic spindle misorientation; and astral microtubules reduction. Furthermore, the suppression or both overexpression of Nek7 wild type or kinase dead impaired the recruitment of ?-tubulin to the spindle pole. These findings introduce the involvement of RGS2 in mitosis and indicate that it may act cooperatively with Nek7 for proper mitotic spindle organization and formation. Finally, employing systems biology, we showed a comprehensive Neks interactome, highlighting for a possible crosstalking of all family members in centrioles and mitosis regulation; ciliary and ciliopathies function; and response to DNA damage / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Jörg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:34:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MarcosTadeudos_D.pdf: 15943486 bytes, checksum: 39810fdf0ace76e5e8963354bdc460ca (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O objetivo deste projeto foi estudar genes ativados em células do estroma da medula óssea, induzidos pela co-cultura com blastos leucêmicos, na tentativa de uma melhor compreensão sobre o crostalk entre estas células no microambiente tumoral. Nós identificamos Stanniocalcina-1 (STC1) como um potencial marcador molecular do microambiente tumoral, uma vez que sua expressão foi aumentada cerca de 7 vezes em células do estroma co-cultivadas com blastos leucêmicos primários. STC1 humana é uma glicoproteína secretada e tem sido descrita participando em diferentes processos fisiológicos, incluindo a angiogênese, hipóxia e principalmente, a carcinogênese. Nós produzimos a proteína recombinante STC1 no sistema baculovírus e também anticorpos monoclonais, usados em um ensaio ELISA, que agora será testado como um novo kit de diagnóstico de leucemia por uma empresa brasileira. Além disso, identificamos novos parceiros de interação para STC1 através do sistema de duplo hibrido em levedura sendo que algumas destas interações foram confirmadas por GST-pull down. A região Nterminal foi identificada como sendo a região responsável pela interação de STC1 com seus parceiros. Estudos de localização sub-celular por microscopia, revelaram uma deposição ubíqua citoplasmática e puntiforme nuclear, lembrando corpúsculos nucleares relacionados a SUMOilação. Embora STC1 interaja com a proteína SUMO1 e tenha uma predição de alta probabilidade para ser SUMOilada, ensaios in vitro e in vivo não conseguiram detectar STC1 SUMOilada. No entanto, observamos que STC1 regula a SUMOilação de forma significativa em três outras proteínas. Essas descobertas sugerem um novo papel para STC1 no ciclo de SUMOilação, agindo como uma SUMO E3 ligase. Observamos também que STC1 possui um receptor na membrana plasmática em linhagem de células leucêmicas K562 e que a incubação de STC1 com outras células leucêmicas parece favorecer a proliferação destas células ao passo que estimula uma maior produção da própria STC1 intracelular em células do estroma. Juntos, todos estes resultados abrem novas pistas promissoras a serem exploradas no futuro, uma vez que todos os resultados mostram ligações interessantes com estudos funcionais anteriores em STC1 / Abstract: The aims of this project is to study upregulated genes on bone marrow stromal cells, induced by the co-culture with leukemic blasts, trying to have a better understand about the crosstalk between these cells in the tumor microenvironment. We identified Stanniocalcin-1 (STC1) as a putative molecular marker for the leukemic microenvironment, once its expression was increased around 7 times in stromal cells co-cultivated with primary leukemic blasts. Human STC1 is a secreted glycoprotein that has been implicated in different physiological process, including angiogenesis, hypoxia and mainly in carcinogenesis. We produced the recombinant protein STC1 in baculovirus system and monoclonal antibodies for an ELISA assay that now will be tested as a new leukemia diagnostic kit by a Brazilian company. Moreover, we identified new interacting protein partners for STC1 by yeast two hybrid system and some of these interactions were confirmed by GST-pull down assays. The N-terminal region was mapped to be the region that mediates the interaction between STC1 and its partners. Microscopic subcellular localization, revealed an ubiquitous cytoplasmic and dot-like nuclear deposition, resembling SUMOylation related nuclear bodies. Although STC1 interacts with SUMO-1 and has a high theoretical prediction score for a SUMOylation site, in vitro and in vivo assays could not detect STC1 SUMOylation. However, we found that STC1 significantly regulates the SUMOylation of three other proteins. These ??ndings suggest a new role for STC1 in SUMOylation cycle, acting as a SUMO E3 ligase. We either observe that STC1 has a plasmatic membrane receptor in K562 leukemic cell lines and the incubation of STC1 with other leukemic cells suggest a increase of proliferation of these cells and stimulates the production of more intracellular STC1 at stromal cells. Together, all of these findings open promising new avenues to be explored in future detailed studies, since they all show interesting connections with previous functional studies on STC1 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular