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Previous issue date: 2016-07-29 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A grande diversidade de estirpes de Staphylococcus aureus em circulação nos rebanhos leiteiros reforça a necessidade de uma melhor caracterização dessas bactérias a fim de gerar informações que possam ser usadas no controle da mastite bovina. Neste trabalho, hipotetizou-se que estirpes de S. aureus geneticamente relacionadas causam diferentes formas de mastite. As bactérias S. aureus 302 e S. aureus 322, foram isoladas de vacas com mastite persistente e não-persistente, respectivamente, e apresentaram os mesmos genes de virulência e perfis de bandas idênticos quando genotipadas por análise em multilocus de repetições em tandem de número variável (MLVA). Por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE), utilizado como um método genotípico adicional, comprovou-se que as bactérias são geneticamente relacionadas. Apesar dessa proximidade, ensaios in vitro de produção de biofilme, hemólise, invasão e persistência em células mamárias bovinas MAC-T e virulência in vivo em modelo Galleria mellonella comprovaram diferenças significativas entre as estirpes. Os resultados sugerem que apenas a caracterização molecular é insuficiente para correlacionar sintomas da doença à uma determinada estirpe. S. aureus 302 e S. aureus 322, além de S. aureus 469 (mastite persistente) e S. aureus 366 (mastite não-persistente) foram contrastadas por uma abordagem proteômica. Extratos de proteínas totais foram preparados a partir de bactérias crescidas até a fase exponencial e separados por eletroforese bidimensional. Um total de 35 spots com abundância diferencial foi detectado, dos quais três foram exclusivos de S. aureus 302 quando comparada a S. aureus 322 e S. aureus 366 e podem representar marcadores que indicam a persistência da bactéria no animal. Este trabalho também avaliou a dispersão de biofilmes de S. aureus NRS 155 e S. epidermidis NRS 101 pela lectina BjcuL, isolada de Bothrops jararacussu. Essa lectina não impediu a adesão inicial das células e foi capaz de inibir a formação de biofilmes quando pré-aderida a superfícies abióticas. Houve uma melhor atividade sobre biofilme pré-formado de S. aureus NRS 155 em comparação S. epidermidis NRS 101. Por qRT-PCR, detectou-se uma alteração na expressão de genes envolvidos no controle do operon ica, responsável pela produção do polissacarídeo de adesão intercelular. Finalmente, BjcuL foi capaz de restaurar a susceptibilidade de bactérias em biofilme pré-formado a antibióticos como gentamicina e ampicilina, revelando o potencial da estratégia antibiofilme no controle de infecções de S. aureus. / The great diversity of Staphylococcus aureus strains isolated from milk- producing cattle reinforces the need of bacterial characterization to raise information that can be used in the control of bovine mastitis. In this work, we hypothesized that genetically related S. aureus strains can cause different forms of mastitis. The strains S. aureus 302 and S. aureus 322 were isolated from cows with persistent and non-persistent mastitis, respectively, and harbored the same virulence genes and identical banding profiles when genotyped by multilocus variable-number tandem repeats analysis (MLVA). Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was used as an additional genotyping method and confirmed that the bacteria were genetically related. Despite close proximity, in vitro assays like biofilm production, hemolysis, invasion, and persistence in the bovine mammary epithelial cells (MAC-T) and also in vivo assessment of virulence in the Galleria mellonella model revealed significant differences between the strains. These results suggest that molecular analysis alone is insufficient to establish a link between a bacterial strain and the clinical symptoms of mastitis. Also in this work, S. aureus 302 and S. aureus 322 besides the strains S. aureus 469 (persistent mastitis) and S. aureus 366 (non- persistent mastitis) were analyzed using a proteomic approach. Extracts of intracellular proteins were prepared from bacteria grown until exponential phase and separated by two-dimensional electrophoresis. A total of 35 spots differentially expressed was detected while three of them were exclusive of S. aureus 302 when compared to S. aureus 322 and S. aureus 366, and may represent markers of bacterial persistence in animals. Finally, this study studied the dispersion of S. aureus NRS 155 and S. epidermidis NRS 101 biofilms by the lectin BjcuL isolated from Bothrops jararacussu. The lectin did not prevent the initial adherence of bacterial cells and inhibited biofilm formation when abiotic surfaces were pre-coated with the protein. Anti-biofilm activity was higher on S. aureus NRS 155 preformed biofilms in comparison to S. epidermidis NRS 101. Change in the expression of genes involved in the control of the ica operon, responsible for the production of polysaccharide intercellular adhesin, was detected by qRT-PCR. BjcuL restored susceptibility of preformed biofilms to gentamicin and ampicillin, revealing the potential of antibiofilm strategy to control S. aureus infections.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/9363 |
| Date | 29 July 2016 |
| Creators | Aguilar, Ananda Pereira |
| Contributors | Ramos, Humberto Josué de Oliveira, Oliveira, Leandro Licursi de, Klein, Raphael Contelli, Ribon, Andréa de Oliveira Barros |
| Publisher | Universidade Federal de Viçosa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFV, instname:Universidade Federal de Viçosa, instacron:UFV |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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