Τα λιποσώματα αναπτύχθηκαν αρχικά από τον Alec Bangham το 1964. Έκτοτε μελετώνται τόσο ως φορείς βιοδραστικών ενώσεων όσο και ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών με σκοπό την αποσαφήνιση της δομής και των λειτουργιών τους. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι αποτελούνται από τα ίδια δομικά συστατικά με εκείνα των βιολογικών μεμβρανών και η ευελιξία της δομής τους προσφέρει τη δυνατότητα προσομοίωσης της δομής και σύστασης διαφορετικών βιολογικών μεμβρανών.
Στις εφαρμογές του ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης, cold atmospheric pressure plasma (CAPP), που μελετώνται τα τελευταία χρόνια συγκαταλέγονται και βιοιατρικές εφαρμογές. Συγκεκριμένα μελετάται η χρήση του ως μέσω απολύμανσης και αποστείρωσης, στην ανάπλαση δέρματος, ως αντικαρκινική θεραπεία κ.τ.λ. Εντούτοις ο ακριβής μηχανισμός της αλληλεπίδρασης του ψυχρού πλάσματος ατμοσφαιρικής πίεσης με κύτταρα και ιστούς δεν είναι ακόμα πλήρως κατανοητός.
Παρότι οι μέχρι τώρα μελέτες για την αποσαφήνιση της αλληλεπίδρασης αυτής πραγματοποιούνται με την χρήση κυτταρικών καλλιεργειών, η χρήση λιποσωμάτων είναι μια πιθανή εναλλακτική. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η χρήση λιποσωμικών διασπορών, ως μοντέλα κυττάρων, έχει αποδειχθεί μια πιο εύκολη, ταχύτερη και χαμηλότερου κόστους εναλλακτική των κυτταρικών καλλιεργειών για την αποσαφήνιση βιολογικών διεργασιών.
Η παρούσα εργασία έχει ως σκοπό τη διερεύνηση της δυνατότητας χρήσης των λιποσωμάτων ως μοντέλα βιολογικών μεμβρανών για την μελέτη της αλληλεπίδρασης του CAPP με κύτταρα. Μελετήθηκε η αλληλεπίδραση λιποσωμάτων – CAPP και επιχειρήθηκε η παραμετροποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής.
Τα λιποσώματα, που εγκλωβίζουν υδατικό διάλυμα καλσεΐνης, παρασκευάσθηκαν με την τεχνική της ενυδάτωσης λεπτού υμενίου και έγινε χρήση υπερήχησης με σκοπό την μείωση του μεγέθους τους. Τα λιπίδια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: φωσφατιδυλοχολίνη, φωσφατιδυλογλυκερόλη και χοληστερόλη. Υπέστησαν επεξεργασία τόσο με CAPP όσο και με αφόρτιστο φέρον αέριο. Ο χαρακτηρισμός των λιποσωμάτων έγινε μέσω μέτρησης των φυσικοχημικών τους χαρακτηριστικών. Ως μέτρο της αλληλεπίδρασης CAPP-λιποσωμάτων χρησιμοποιήθηκε η μεταβολή του εγκλωβισμού της καλσεΐνης. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε μορφολογική ανάλυση των λιποσωμάτων, μέσω ηλεκτρονιακής μικροσκοπίας σάρωσης, πριν και μετά την επεξεργασία. Με σκοπό την παραμετροποίηση της αλληλεπίδρασης αυτής έγινε μελέτη της μεταβολής των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των λιποσωμάτων ως συνάρτηση του χρονικού διαστήματος επεξεργασίας και του χρόνου επώασης (σε PBS στους 4C) μετά την επεξεργασία.
Επιπλέον πραγματοποιήθηκαν πειράματα αλληλεπίδρασης του CAPP με κύτταρα B-16, καρκινικά κύτταρα μελανώματος ποντικού.
Ως οι κυριότεροι παράγοντες της αλληλεπίδρασης CAPP – λιποσωμάτων διαφαίνονται η συγκέντρωση της λιποσωμικής διασποράς και ο χρόνος επεξεργασίας. Η μείωση του ποσοστού εγκλωβισμού της καλσεΐνης αυξάνεται ανάλογα με την αύξηση τόσο της συγκέντρωσης όσο και του χρόνου επεξεργασίας. Επιπλέον η λιπιδική σύσταση επηρεάζει το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης. Η ύπαρξη αρνητικού επιφανειακού φορτίου επηρεάζει θετικά το αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης ενώ η ύπαρξη χοληστερόλης οδηγεί σε πιο ανθεκτικά λιποσώματα μόνο στη μέγιστη συγκέντρωση (50%). Μείωση του μεγέθους και του αριθμού των διπλοστιβάδων των λιποσωμάτων οδηγεί σε πιο ευαίσθητα κυστίδια. Διαφυγή της καλσεΐνης παρατηρήθηκε μέχρι και 96 ώρες μετά την επεξεργασία ενώ με το πέρας του χρόνου παρατηρήθηκε επιπλέον συσσωμάτωση των κυστιδίων, το οποίο επιβεβαιώνεται με μορφολογικές μελέτες, και μεταβολή τους επιφανειακού τους φορτίου.
Η επίδραση του CAPP στα κύτταρα Β-16 επηρεάζεται τόσο από την αρχική πληρότητα (confluence) της καλλιέργειας όσο και από τις διαστάσεις των κελιών της χρησιμοποιούμενης πλάκας.
Παρότι η ανωτέρω ανάλυση υποστηρίζει την αρχική υπόθεση, απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση της αλληλεπίδρασης του CAPP με βιολογικά δείγματα. / Liposomes were originally developed by Alec Bangham in 1964. Since then, they have been studied as carriers of bioactive compounds and as biological membrane models in structural and functional studies. This is due to the fact that they are composed of the same building blocks as biological membranes and because their structural versatility offers the opportunity to create vesicles that resemble the structure and composition of different biological membranes.
In recent years cold atmospheric pressure plasma, CAPP, has been studied for a variety of applications some of which are found in the biomedical milieu. More precisely these applications include: decontamination, sterilization, skin regeneration, tumor treatment, etc. Nevertheless the exact mechanism of the interaction between CAPP and cells/tissue is not yet completely understood. Although currently researchers use cell cultures to investigate this interaction, liposomes could be an alternative. The applicability of liposomal dispersions, as cell models, has proved to be an easier, faster and less expensive tool for the investigation of cell – cellular environment interactions.
The purpose of this thesis was to investigate the possibility of using liposomes as cell membrane models to study the CAPP-cells interactions. The CAPP-liposomes interaction was studied and parameterization of this interaction was attempted. Calcein-encapsulating liposomes were prepared using the thin-film hydration technique and the sonication technique was used to decrease the size of the vesicles. The lipids used were: phosphatidylcholine, phosphatidylglycerol and cholesterol. The samples were treated both with CAPP and with the uncharged carrier-gas. Characterization of liposomes was made by measuring their physicochemical characteristics. The variation of the percent of calcein encapsulation was used to measure the effect of CAPP-liposomes interaction. Moreover morphological evaluation of the samples before and after treatment was realized thought scanning electron microscopy, SEM. The variation of liposomes’ physicochemical characteristics versus time, duration of treatment and incubation (in PBS at 4C), was realized in order to parameterize this interaction. The effect of CAPP on B-16 cells, mouse melanoma cancer cells, was also investigated.
The major parameters of the CAPP-liposomes interaction were proved to be the concentration of the liposomal dispersion and the duration of treatment. The increase of both the lipid concentration and the duration of treatment lead to increase of the reduction of calcein’s encapsulation provoked by CAPP treatment. The composition of the liposomal membrane also affects the interaction’s result. Negative surface charge increases the impact of CAPP and the presence of cholesterol leads to more stable structures only when its concentration is maximum (50%). Reduction of the size and lamellarity of the vesicles leads to more fragile liposomes. Release of calcein was observed even 96 hours after treatment in combination with aggregation of the vesicles, which was also proved via morphological evaluation, and change of liposomes’ surface charge.
The impact of CAPP treatment on B-16 cells seems to depend on the initial confluence of the culture as well as the dimensions of the plate’s wells. Although the aforementioned analysis supports the initial hypothesis, further investigation of the interaction between CAPP and biological samples is necessary.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upatras.gr/oai:nemertes:10889/8581 |
| Date | 12 June 2015 |
| Creators | Ματραλή, Σοφία - Στυλιανή |
| Contributors | Αντιμησιάρη, Σοφία, Matrali, Sofia - Styliani, Σβάρνας, Παναγιώτης, Κλεπετσάνης, Παύλος |
| Source Sets | University of Patras |
| Language | gr |
| Detected Language | Greek |
| Type | Thesis |
| Rights | 12 |
| Relation | Η ΒΚΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. |
Page generated in 0.0028 seconds