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Previous issue date: 2009-03-23 / A tuberculose (TB) ? considerada uma amea?a ? sa?de p?blica mundial; segundo a Organiza??o Mundial da Sa?de, cerca de dois milh?es de pessoas morrem anualmente em conseq??ncia desta doen?a. Uma das caracter?sticas mais importantes do pat?geno causador da TB ? a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo per?odo em um estado de lat?ncia, tamb?m conhecido como persist?ncia. A import?ncia do estado de lat?ncia ? sobreviv?ncia do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infec??o por M. tuberculosis. O entendimento do modo de a??o e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se poss?vel, prevenir a progress?o e a reativa??o da doen?a. A citidina deaminase (CDA, EC 3.5.4.5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrol?tica de citidina e 2'-desoxicitidina para formar uridina e 2'-desoxiuridina, respectivamente. O prov?vel gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seq?enciado e expresso em c?lulas de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purifica??o da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de prote?na homog?nea a partir de 10 g de c?lulas. A an?lise de espectrometria de massas, seq?enciamento N-terminal e cromatografia por gel filtra??o confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligom?rico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento m?ltiplo de seq??ncias sugere que MtCDA ? um homotetr?mero em solu??o. Medidas de cin?tica em estado estacion?rio da CDA geraram os seguintes par?metros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 uM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 uM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A depend?ncia dos valores de kcat e kcat/KM em fun??o do pH para citidina indicam que a protona??o de um ?nico grupo ioniz?vel com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protona??o de um grupo com pKa de 4,7 reduz a liga??o ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o m?todo de difus?o de vapor em gota pendente. A demonstra??o de que o locus Rv3315c codifica uma prote?na com atividade CDA em M. tuberculosis ? o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e dever? ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede2.pucrs.br:tede/5337 |
| Date | 23 March 2009 |
| Creators | Quitian, Zilpa Adriana S?nchez |
| Contributors | Santos, Di?genes Santiago |
| Publisher | Pontif?cia Universidade Cat?lica do Rio Grande do Sul, Programa de P?s-Gradua??o em Biologia Celular e Molecular, PUCRS, BR, Faculdade de Bioci?ncias |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 8198246930096637360, 600, 600, 36528317262667714 |
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