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Previous issue date: 2017-02-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Second generation bioethanol employs lignocellulosic materials in its preparation. One
of the steps for these materials degradation utilizes cellulases produced by
microorganisms. Among these, Trichoderma reesei fungus is one of the main
cellulases producers used in industry. This fungus genetic modification can lead to
enzimes production optimization, reducing cost and improving biofuels manufacture.
Thus, the present work objective was delete the sequence encoding zinc fingers motifs
of cellulase ACE1repressor transcription factor from T. reesei RUT-C30 fungus,
seeking enzymatic production optimization. In primers construction for amplification
ACE1 regions 5’ and 3' and the hph selection marker, which confers hygromycin B
resistance, Joint Genome Institute - JGI site and the BioEdit ® program were used.
The deletion cassette with pRS426 vector construction was mediated by
Saccharomyces cerevisiae SC9721 yeast. After the cassette construction, T. reesei
RUT-C30 transformation was made by protoplast and this transformation confirmation
was effected by part of the hph using hphNestF and hphNestR amplification primers.
After transformation with mutants obtained, endoglucanase, exoglucanase and total
cellulase activity was quantified with carboxymethylcellulose substrates (CMC),
microcrystalline cellulose (Avicel®) and Whatman paper filter (PF), respectively. The
enzymatic production and biomass hydrolysis efficiency were performed comparing
RUT-C30 strain for mutants. After deletion cassette construction, a 3501 bp fragment
amplification confirmed the cassette formation. Posteriorly, RUT-C30 strain
transformation, a 989 bp amplification was observed, confirming the 3 mutants target
sequence deletion. With cellulase activity assay, 3 transformed strain showed higher
enzymatic production when compared to RUT-C30 strain. In this comparison, a
significant statistical difference was observed of RUT-C30Δace1-1 strain with Avicel®
and PF (p <0.001) CMC (p <0.01), RUT-C30Δace1-2 strain with CMC (p<0,01) e PF
(p<0,05), and RUT-C30Δace1-3 strain with Avicel (p<0,001), CMC and PF (p<0,01).
The mutants also showed greater efficiency in biomass hydrolysis, with release sugar
increase between 21 and 42%. Based on this study, mutants are promising for most
efficient and viable ethanol production. Nevertheless, additional tests must be carried
out to better understand these fungi applicability in the industrial level. / O bioetanol de segunda geração emprega materiais lignocelulósicos na sua
elaboração. Uma das etapas para a degradação destes materiais utiliza celulases
produzidas por microrganismos. Dentre estes, o fungo Trichoderma reesei é um dos
principais produtores de celulases utilizadas na indústria. A modificação genética
deste fungo pode levar à otimização da produção de suas enzimas, diminuindo o custo
e melhorando a fabricação de biocombustíveis. Desta forma, o objetivo do trabalho foi
deletar a região dos motivos dedos de zinco no gene que codifica o fator de transcrição
repressor de celulase ACE1 do fungo T. reesei RUT-C30, buscando a otimização na
produção enzimática. Na construção dos primers para amplificação das regiões 5’ e
3’ de ace1 e do marcador de seleção hph, que confere resistência à higromicina B,
utilizou-se o site Joint Genome Institute – JGI e o programa BioEdit®. A construção do
cassete de deleção com o vetor pRS426 foi mediado pela levedura Saccharomyces
cerevisiae SC9721. Posteriormente, a construção do cassete, a transformação de T.
reesei RUT-C30 foi realizada através de protoplasto e a confirmação desta
transformação foi efetuada por amplificação de parte do hph utilizando os primers
hphNestF e hphNestR. Após a transformação, com os mutantes obtidos, a atividade
de endoglucanase, exoglucanase e celulase total foi quantificada com os substratos
carboximetilcelulose (CMC), celulose microcristalina (Avicel®) e papel de filtro
Whatman (PF), respectivamente. A produção enzimática e a eficiência na hidrólise da
biomassa foram realizadas comparando-se a linhagem RUT-C30 aos mutantes. Após
a construção do cassete de deleção, a amplificação de um fragmento de 3501 pb
confirmou a formação do cassete. E, posteriormente à transformação da linhagem
RUT-C30, o amplificado de 989 pb foi observado, confirmando a deleção da sequência
alvo em 3 mutantes. Com o ensaio de atividade de celulases, as 3 linhagens
transformadas mostraram maior produção enzimática quando comparadas à linhagem
RUT-C30. Nessa comparação, foi observada diferença estatística significativa da
linhagem RUT-C30Δace1-1 com Avicel® e PF (p<0,001), da linhagem RUTC30Δace1-
2 com CMC (p<0,01) e PF (p<0,05) e da linhagem RUT-C30Δace1-3 com
Avicel (p<0,001), CMC e PF (p<0,01). Os mutantes também apresentaram maior
eficiência na hidrólise da biomassa, com aumento na liberação de açúcar entre 21 e
42%. Com base nos dados deste estudo, os mutantes apresentam-se promissores
para a produção mais eficiente e viável de etanol. Apesar disso, testes adicionais
devem ser realizados para melhor entendimento da aplicabilidade destes fungos a
nível industrial.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.unioeste.br:tede/2954 |
| Date | 07 February 2017 |
| Creators | Dudek, Débora Nakadomari |
| Contributors | Maller, Alexandre, Maller, Alexandre, Silva, José Luís da Conceição, Maller, Ana Cláudia Paiva Alegre |
| Publisher | Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Cascavel, 6588633818200016417, 500, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, UNIOESTE, Brasil, Centro de Ciências Médicas e Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do UNIOESTE, instname:Universidade Estadual do Oeste do Paraná, instacron:UNIOESTE |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 7878055067573953101, 600, 600, 600, 600, -8940439713387849267, 6997636413449754996, 2075167498588264571 |
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