A resistência das paredes celulares vegetais à hidrólise enzimática é um dos grandes gargalos tecnológicos para a obtenção do etanol celulósico. Acredita-se que as modificações nas paredes celulares em processos como a mobilização de reservas, formação de aerênquima, amadurecimento de frutos e senescência, por exemplo, envolvam a ativação de módulos funcionais que culminam em alterações nas paredes celulares. Estes módulos são: 1) recepção de um sinal para início do processo; 2) Morte Celular Programada (PCD); 3) separação celular; 4) expansão celular; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. No caso da formação de aerênquimas lisígenos o processo que se inicia com a PCD e é seguido pela liberação de glicosil hidrolases que atuam a na degradação e/ou modificação da parede celular, formando espaços de ar no córtex radicular. A formação de aerênquima nas raízes de cana de açúcar é constitutiva e pouco se sabe sobre os mecanismos de modificação que ocorrem na parede celular durante este processo. Este estudo buscou compreender os padrões de variação expressão gênica, proteínas e de atividades enzimáticas associados à formação do aerênquima em raízes de cana de açúcar, com ênfase no papel das hidrolases de parede celular e em algumas proteínas relacionadas à PCD. Foram utilizados 5 segmentos de raízes de 1 cm cada, a partir do ápice radicular. No material coletado observou-se a formação gradual de aerênquima. Foram realizadas análises transcricional, proteômica e atividade enzimática das glicosil hidrolases e outras proteínas que atuam na modificação da parede celular, os quais foram identificados e quantificados ao longo da formação do aerênquima. As glicosil hidrolases pertencentes às famílias Cazy GH1, GH3, GH17, GH18 bem como expansinas, celulose sintase, lacase, calreticulina, calmodulina e proteínas relacionadas a degradação de pectinas, foram encontradas ao longo dos segmentos, principalmente após o segmento 2. De acordo com a atividade transcricional e dados da proteômica, sugere-se que os polissacarídeos seriam atacados por enzimas nos estágios iniciais da formação do aerênquima (seg 2 e 3). O ataque ocorre principalmente sobre as pectinas e o β-glucano. Contudo, os dados apontam para a deposição de xiloglucano, xilanos e celulose (após seg 3), que formam um compósito ao redor dos espaços de ar. Isto sugere que parte dos polissacarídeos das paredes não sejam degradados ao longo do processo, embora enzimas específicas detectadas possam atuar na modificação dos mesmos, como verificado para algumas pectinases e membros de GH17. Além disso, nos pré-tratamentos com água foi possível observar que há maior sacarificação da parede nos seg. 1 e 2. Contudo quando retira-se a maior parte das pectinas e hemiceluloses após pré-tratamento com NaOH, a sacarificação é maior nos segmentos 2, 3 e 4, devido ao maior acesso e a maior quantidade de celulose. As glicosil hidrolases encontradas neste trabalho sugerem que estas atacam a parede de um específico conjunto de células do córtex que dá origem ao aerênquima. Já no fim do processo, quando há lise celular, algumas paredes de células remanescentes são recalcitrante à hidrólise, provavelmente devido a sua arquitetura e composição. Este trabalho traz informações para o desenvolvimento de futuras tecnologias para a produção do etanol do etanol celulósico de cana-de-açúcar / The resistance of plant cell walls to enzymatic hydrolysis is one of the main bottlenecks of the development of technology of production of cellulosic ethanol. It is believed that the modifications in cell walls related to processes of storage mobilization, aerenchyma formation, fruit ripening and senescence, for instance, involve the activation of functional moduli that culminate in alterations of cell walls. These moduli are: 1) signal perception to start the process; 2) Programmed Cell Death (PCD); 3) cell separation; 4) cell expansion; 5) hydrolysis of hemicelluloses and 6) hydrolysis of cellulose. In the case of the formation of lysigenous aerenchyma, the process starts with PCD and is followed by the release of glycosil hydrolases that act on the degradation and/or cell wall modifications, forming air spaces in the cortex of the root. The formation of aerenchyma in the roots of sugarcane is a constitutive phenomenon and little is known about the mechanisms of modification that occur in cell walls during its development. Thus, the present study focused on the visualization of the patterns of variation of gene expression, proteins and enzyme activities associated to the formation of aerenchyma in roots of sugarcane in order to understand the role of the cell wall hydrolases and some proteins related to PCD in cell wall modifications along the process. Five root segments of 1cm each, starting from root apex, were used. A gradual centripetal formation of aerenchyma was recorded in the cortex of developing roots. Analyses of the transcriptional, proteomic and enzyme activity profiles during the process revealed that several enzymes act on cell wall modifications. The glycosil hydrolases belonging to the Cazy families GH1. GH3, GH17, GH18, as well as expansins, cellulose synthase, laccase, calreticulin, calmodulin and other proteins related to pectin degradation have been found along the segments, mainly after segment 2. According to the data on transcriptomics and proteomics, it is suggested that enzymes attack polysaccharides during the initial stages of aerenchyma formation (seg. 2 and 3). The attack of the enzymes occurs mainly on pectins and β-glucan. Conversely, the data point out to the deposition (or maintenance) of xyloglucan, xylan and cellulose (after seg. 3), which form a composite that surrounds the air spaces. This suggests that part of the polysaccharides present in cell walls are not degraded during the process, although specific enzymes have been detected that could act on polysaccharide mobilization, such as the GH17 family. Further, under pretreatment with water, it has been observed that cell wall saccharification was higher at segments 1 and 2. On the other hand, when most of the pectins and hemicelluloses are retrieved by pretreatment with NaOH, saccharification is higher of segments 2, 3 and 4, probably due to the higher access to the wall and also to the higher proportion of cellulose. The profiles related to the glycosil hydrolases found in this work, suggest that these enzymes attack the cell wall. Initially, they are probably kept within a group of cells that will originate the aerenchyma. At the end of the process, when there is cell lysis, the remaining walls of some cells are recalcitrant to hydrolysis probably due to changes in their architecture and composition. Our findings bring promising information that could be used in the future to improve efficiency of hydrolysis for cellulosic ethanol production from sugarcane
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-20052015-101637 |
| Date | 27 February 2015 |
| Creators | Grandis, Adriana |
| Contributors | Buckeridge, Marcos Silveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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