SOARES, Emanoella Lima. Ontogenia da semente e análise proteômica do integumento interno de Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae). 2015. 140 f. Tese (Doutorado em agronomia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-08-29T19:38:50Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_elsoares.pdf: 7282259 bytes, checksum: ec0170f99ad9db205c410e9f12d78bb5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-08-29T22:54:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_elsoares.pdf: 7282259 bytes, checksum: ec0170f99ad9db205c410e9f12d78bb5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-29T22:54:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_elsoares.pdf: 7282259 bytes, checksum: ec0170f99ad9db205c410e9f12d78bb5 (MD5) Previous issue date: 2015 / The economic importance of J. curcas is due to the high amount of oil accumulated in their seeds, specifically in the endosperm. In this context, the events related to the endosperm formation and the accumulation of toxic compounds in the seeds could help in the production of varieties that produce more oil and are less toxic. Thus, anatomical, proteomic and gene expression analysis were made with J. curcas seeds to contribute with the knowledge about physiologic events related with the formation of endosperm and the processes of synthesis and accumulation of phorbol esters. The anatomical analysis showed the maternal tissue responsible for the nutrients transfer to the endosperm and contributed to fill the gaps present in the literature about the anatomy of J. curcas seeds. The inner integument is the maternal tissue that presents the vasculature of the mother plant and is the responsible for the nutrition of the endosperm through the process of programmed cell death (PCD). Based on this result proteomic analysis of two anatomically different regions of the inner integument, named as proximal and distal, were performed. The identified proteins indicated that the inner integument pass through PCD in different degrees in the proximal and distal regions and that in this tissue there is a spatial distribution between catabolism and anabolism. In the proximal region especially hydrolases were identified and in the distal region storage proteins and proteins of biosynthetic pathways were prevalent. The gene expression analysis had two purposes: first, verify wether the transcripts levels of the genes likely involved in PCD, whose proteins were identified and quantified in the proteomic analysis, were related to the protein abundance and second, identify the site of synthesis of the committed enzyme in the phorbol esters biosynthesis, the casbene synthase, through a study with root, leaf, embryo, inner integument and endosperm and 14 putative genes of the mentioned enzyme. The results indicated that the proteins related to PCD must be controlled at transcript level. Nine putative genes from casbene synthase were expressed in roots and one of them was expressed in the leaf and embryo. This work denotes the role of PCD in the inner integument to the development of the seed and also demonstrates the transitory nature of storage of this tissue. In addition gives notation that the seed, despite of accumulates phorbol esters, do not synthesizes these compounds, but probably import them from roots. / A importância econômica da espécie J. curcas deve-se a grande quantidade de óleo acumulada em suas sementes, especificamente no endosperma. Os eventos relacionados à formação do endosperma e ao acúmulo de compostos tóxicos nas sementes podem auxiliar na produção de variedades com maior produção de óleo e menos tóxicas. Visando isso, foram realizadas análises anatômicas, proteômicas e de expressão de genes nas sementes de J. curcas para contribuir com o entendimento sobre os eventos fisiológicos associados à formação do endosperma e aos processos de síntese e acúmulo dos ésteres de forbol. A análise anatômica mostrou o tecido maternal responsável pela transferência de nutrientes para o endosperma e contribuiu para resolver lacunas existentes na literatura sobre a anatomia de sementes de J. curcas. O integumento interno é o tecido maternal que apresenta a vascularização da planta-mãe e é o responsável pela nutrição do endosperma através do processo de morte celular programada (PCD). Com base nesse resultado, realizou-se uma análise proteômica do integumento interno na região proximal e distal ao endosperma, uma vez que as características celulares indicativas de PCD nesse tecido se apresentavam diferentes nessas regiões. As proteínas identificadas indicaram que o integumento interno sofre PCD em diferentes graus nas diferentes regiões e que nesse tecido há uma distribuição espacial entre catabolismo e anabolismo, pois na região proximal identificaram-se principalmente hidrolases e na região distal proteínas de reserva e de vias biossintéticas. A análise de expressão de genes teve dois propósitos: primeiro, verificar se os níveis de transcritos de genes possivelmente relacionados à PCD, cujas proteínas foram identificadas e quantificadas na análise proteômica, estavam relacionados à abundância de proteínas e o segundo foi identificar o local de síntese da enzima comprometida na biossíntese dos ésteres de forbol, a sintase do casbeno, através de um estudo com raiz, folha, embrião, integumento interno e endosperma e 14 genes candidatos à enzima mencionada. Os resultados indicaram que as proteínas relacionadas à PCD devem ser controladas no âmbito transcricional. Nove genes candidatos à sintase do casbeno foram expressos em raiz e um deles foi expresso na folha e no embrião. Este trabalho evidencia o papel da PCD no integumento interno para o desenvolvimento da semente, além de demonstrar a natureza transitória de reserva desse tecido. Adicionalmente, dá indícios de que a semente, apesar de acumular ésteres de forbol, não sintetiza esses compostos, mas possivelmente os importa das raízes.

LIMA, Magda Laiara Bezerra de. Análise ultraestrutural e molecular do desenvolvimento do integumento interno de sementes de Jatropha curcas L. 2017. 102 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Anderson Silva Pereira (anderson.pereiraaa@gmail.com) on 2017-05-02T19:58:45Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_mlblima.pdf: 7882259 bytes, checksum: 57d42e334a50ab63d28f9035b1d8229b (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-05-17T18:58:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_mlblima.pdf: 7882259 bytes, checksum: 57d42e334a50ab63d28f9035b1d8229b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-17T18:58:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_mlblima.pdf: 7882259 bytes, checksum: 57d42e334a50ab63d28f9035b1d8229b (MD5) Previous issue date: 2017 / Jatropha curcas L. is a species of oleaginous plant that arouses economic interest because it is an alternative source for biodiesel production although little is known about the biology of the development of this plant organism. This knowledge can serve as a basis for the domestication of this species and the discovery of probable solutions for seed toxicity due to the presence of the phorbol esters in the seeds, for example. J. curcas seeds are made up by the embryo, endosperm as well as the surrounding seed coat. The latter is derived from the development of both outer (oi) and inner (ii) integuments. It is known that the ii may act as a transient storage tissue providing carbon and nitrogen sources for the development of the filial tissues, endosperm and embryo. Scientific reports indicate that during ii development the cells undergo programmed cell death (PCD). The aimed at observing the changes in the ultrastructure of the ii during its development and confirm the PCD characteristics by assessing the gene expression pattern for seven different hydrolases (arabinofuranosidase, glucanase, peptidase cysteine tailed RDEL, peptidase cysteine tailed KDEL, aspartic peptidase, serine peptidase and subtilisin) and two inhibitors (inhibitor peptidase cysteine and serpin). The stages used in this study (ovule and seeds at 5, 10 and 25 DAP) were selected based on the morphological changes in the ii observed in light microscopy. The vacuolization and cell expansion were the most conspicuous characteristics observed in the early development of the ii. Furthermore, the first related morphological changes related to PCD were observed at 5 DAP, including rising the periplasmic spaces and ricinossomos and collapse of tonoplasto. In later stages, at 10 and 25 DAP, it was observed enlargement of the cell volume, followed by less dense cytoplasm, presence of peroxisomes, lobed nucleus, condensed chromatin, invaginations and disruption of the plasma membrane and finally cell wall breakdown as well as the rising of gerontoplasts (25 DAP). In the early stages (ovule, 5 and 10 DAP) the expression pattern of genes encoding cysteine peptidase tailed KDEL, serine peptidase and subtilisin it was higher at 10 DAP if compared to the calibrator (ovule). In the ii proximal region of seeds with 25 DAP the expression of all peptidases (other than aspartic peptidase), the arabinofuranosidase and glucanase was statistically superior when compared to the distal region. The correlation of the ultrastructural findings and the transcriptional expression pattern indicates that the occurrence of CCM in the internal integument can act in the supply of carbon and nitrogen sources for the development of the embryo and endosperm. / Jatropha curcas L. é uma espécie de planta oleaginosa que desperta interesse econômico por ser uma fonte alternativa para a produção de biodiesel muito embora, pouco se sabe sobre a biologia do desenvolvimento desse organismo vegetal. Esses conhecimentos podem servir de base para a domesticação desta espécie e a descoberta de prováveis soluções para toxicidade das sementes devido a presença dos ésteres de forbol nas sementes, por exemplo. As sementes de J. curcas são constituídas pelo embrião e endosperma, ambos envolvidos pela testa e o tegma. Estes últimos são provenientes do desenvolvimento dos integumentos externo (ie) e interno (ii). É sabido que o ii pode atuar como tecido de armazenamento transeunte de fontes de carbono e nitrogênio para o desenvolvimento dos tecidos filiais, endosperma e embrião. Relatos científicos indicam que durante o desenvolvimento do ii as células sofrem morte celular programada (MCP). Buscou-se observar as modificações na ultraestrutura do ii em decorrência do seu desenvolvimento; além de validar as características da MCP por meio da avaliação do padrão de expressão de sete hidrolases (arabinofuranosidase, glucanase, peptidase cisteínica com cauda RDEL, peptidase cisteínica com cauda KDEL, peptidase aspártica, peptidase serínica e subtilisina) e dois inibidores de peptidase (inibidor de peptidase cisteínica e serpina). Além do óvulo, os estágios utilizados neste estudo (sementes aos 5, 10 e 25 DAP) foram selecionados com base nas modificações morfológicas do ii obtidas através da análise histológica. A vacuolização e a expansão celular foram as características mais conspícuas observadas no início do desenvolvimento do ii. Além disso, as primeiras mudanças morfológicas relacionadas a MCP foram observadas aos 5 DAP, incluindo, surgimento dos espaços periplasmáticos, aparecimento dos ricinossomos, e colapso do tonoplasto. A sequência do processo degradativo foi observada nos estágios mais avançados (10 e 25 DAP) com expansão do volume celular, acompanhado de citoplasma menos denso, presença de peroxissomos, núcleo lobado, cromatina condensada, invaginações e ruptura da membrana plasmática e, finalmente a ruptura da parede celular, além do surgimento dos gerontoplastos (25 DAP). Nos estágios iniciais (óvulo, 5 e 10 DAP) o padrão de expressão relativa dos genes que codificam para peptidase cisteínica KDEL, peptidase serínica e subtilisina foi maior aos 10 DAP quando comparados com o óvulo. Na região proximal do ii das sementes com 25 DAP a expressão de todas as peptidases (exceto peptidase aspártica), a arabinofuranosidase e glucanase foi estatisticamente superior quando comparada à região distal desse mesmo estágio. A correlação dos achados ultraestruturais e o padrão de expressão transcricional indica que a ocorrência da MCP no integumento interno pode atuar no fornecimento de fontes de carbono e nitrogênio para o desenvolvimento do embrião e endosperma.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / The economic importance of J. curcas is due to the high amount of oil accumulated in their seeds, specifically in the endosperm. In this context, the events related to the endosperm formation and the accumulation of toxic compounds in the seeds could help in the production of varieties that produce more oil and are less toxic. Thus, anatomical, proteomic and gene expression analysis were made with J. curcas seeds to contribute with the knowledge about physiologic events related with the formation of endosperm and the processes of synthesis and accumulation of phorbol esters. The anatomical analysis showed the maternal tissue responsible for the nutrients transfer to the endosperm and contributed to fill the gaps present in the literature about the anatomy of J. curcas seeds. The inner integument is the maternal tissue that presents the vasculature of the mother plant and is the responsible for the nutrition of the endosperm through the process of programmed cell death (PCD). Based on this result proteomic analysis of two anatomically different regions of the inner integument, named as proximal and distal, were performed. The identified proteins indicated that the inner integument pass through PCD in different degrees in the proximal and distal regions and that in this tissue there is a spatial distribution between catabolism and anabolism. In the proximal region especially hydrolases were identified and in the distal region storage proteins and proteins of biosynthetic pathways were prevalent. The gene expression analysis had two purposes: first, verify wether the transcripts levels of the genes likely involved in PCD, whose proteins were identified and quantified in the proteomic analysis, were related to the protein abundance and second, identify the site of synthesis of the committed enzyme in the phorbol esters biosynthesis, the casbene synthase, through a study with root, leaf, embryo, inner integument and endosperm and 14 putative genes of the mentioned enzyme. The results indicated that the proteins related to PCD must be controlled at transcript level. Nine putative genes from casbene synthase were expressed in roots and one of them was expressed in the leaf and embryo. This work denotes the role of PCD in the inner integument to the development of the seed and also demonstrates the transitory nature of storage of this tissue. In addition gives notation that the seed, despite of accumulates phorbol esters, do not synthesizes these compounds, but probably import them from roots. / A importÃncia econÃmica da espÃcie J. curcas deve-se a grande quantidade de Ãleo acumulada em suas sementes, especificamente no endosperma. Os eventos relacionados à formaÃÃo do endosperma e ao acÃmulo de compostos tÃxicos nas sementes podem auxiliar na produÃÃo de variedades com maior produÃÃo de Ãleo e menos tÃxicas. Visando isso, foram realizadas anÃlises anatÃmicas, proteÃmicas e de expressÃo de genes nas sementes de J. curcas para contribuir com o entendimento sobre os eventos fisiolÃgicos associados à formaÃÃo do endosperma e aos processos de sÃntese e acÃmulo dos Ãsteres de forbol. A anÃlise anatÃmica mostrou o tecido maternal responsÃvel pela transferÃncia de nutrientes para o endosperma e contribuiu para resolver lacunas existentes na literatura sobre a anatomia de sementes de J. curcas. O integumento interno à o tecido maternal que apresenta a vascularizaÃÃo da planta-mÃe e à o responsÃvel pela nutriÃÃo do endosperma atravÃs do processo de morte celular programada (PCD). Com base nesse resultado, realizou-se uma anÃlise proteÃmica do integumento interno na regiÃo proximal e distal ao endosperma, uma vez que as caracterÃsticas celulares indicativas de PCD nesse tecido se apresentavam diferentes nessas regiÃes. As proteÃnas identificadas indicaram que o integumento interno sofre PCD em diferentes graus nas diferentes regiÃes e que nesse tecido hà uma distribuiÃÃo espacial entre catabolismo e anabolismo, pois na regiÃo proximal identificaram-se principalmente hidrolases e na regiÃo distal proteÃnas de reserva e de vias biossintÃticas. A anÃlise de expressÃo de genes teve dois propÃsitos: primeiro, verificar se os nÃveis de transcritos de genes possivelmente relacionados à PCD, cujas proteÃnas foram identificadas e quantificadas na anÃlise proteÃmica, estavam relacionados à abundÃncia de proteÃnas e o segundo foi identificar o local de sÃntese da enzima comprometida na biossÃntese dos Ãsteres de forbol, a sintase do casbeno, atravÃs de um estudo com raiz, folha, embriÃo, integumento interno e endosperma e 14 genes candidatos à enzima mencionada. Os resultados indicaram que as proteÃnas relacionadas à PCD devem ser controladas no Ãmbito transcricional. Nove genes candidatos à sintase do casbeno foram expressos em raiz e um deles foi expresso na folha e no embriÃo. Este trabalho evidencia o papel da PCD no integumento interno para o desenvolvimento da semente, alÃm de demonstrar a natureza transitÃria de reserva desse tecido. Adicionalmente, dà indÃcios de que a semente, apesar de acumular Ãsteres de forbol, nÃo sintetiza esses compostos, mas possivelmente os importa das raÃzes.

Diversos tipos celulares nas mais variadas condições têm sido usados como doadores de núcleo para a TN. Ainda não está claro se o estado fisiológico destas células afeta o posterior desenvolvimento dos embriões. Neste trabalho, testou-se a hipóese que fibroblastos bovinos em processo de MCP podem ser reprogramados na transferência nuclear. Fibroblastos foram cultivados até atingirem 60% de confluência, sincronizados por restrição de soro durante 24h e em seguida a MCP foi analisada por citometria de fluxo com a ténica da Anexina V/Iodeto de propídeo. Células Anexina positivas (MCP) e Anexinanegativas (Vivas) foram separadas por citometria de fluxo e utilizadas para a TNS. Céulas não coradas e não separadas no citômetro serviram como controle (Controle). Os embriões reconstruídos foram avaliados quanto à fusão, clivagem (2º dia de cultivo), blastocisto (7º dia) e prenhez (D30, D60 e nascimento). O índice de MCP dos blastocistos obtidos foi determinado. Os resultados foram analisados pela ANOVA ou teste de X2 com nível de significância de 5%. Não houve efeito nas taxas de fusão (p>0,05). Embriões reconstruídos com células MCP tiveram menor taxa de clivagem e formação de blastocistos (72,7% e 18,8%, respectivamente) em comparação ao grupo reconstruído com células Vivas (83,4% e 34,7%, respectivamente; p<0,05), não diferindo dos embriões Controle (77,3% e 27,3%, respectivamente; p>0,05). O índice de MCP do grupo de embriões MCP foi similar aos índices dos embriões clonados a partir de células Vivas e Controle (p>0,05). Após a transferência para receptoras, os grupos MCP, Vivas e Controle não diferiram com relação à taxa de prenhez aos 30d (18,1%, 13,3% e 27,5%, respectivamente; p>0,05). Entretanto aos 60d, a perda gestacional no grupo MCP (25%) foi inferior a do grupo Vivas (100%) e Controle (62,5%). Somente um nascimento, do grupo MCP (4,5% dos embriões transferidos), foi obtido no experimento. Conclui-se que células em processo de MCP, podem ser reprogramadas quando utilizadas como doadoras de núcleo na técnica de transferência nuclear, podendo estabelecer gestações e nascimentos, entretanto houve um efeito prejudicial nas taxas de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto assim como houve aumento do índice de MCP nos embriões reconstruídos. / It is not clear if the physiological status of the cells can affect further embryonic development in NT. We hypothesized that adult bovine fibroblasts in PCD can be reprogrammed when used as nuclear donors for cloning. Fibroblasts were cultivated until 60% confluency, synchronized by serum starvation for 24 h and stained with Annexin V and Propidium iodide (PI) by flow citometry. Annexin positive cells (PCD cells) and Annexin negative cells (Live cells) were sorted and used for NT. Unsorted, unstained cells were used as control (Control cells). After reconstruction, fusion, cleavage (day 2 of culture), blastocyst (day 7) and pregnancy rates (day 30, 60 and birth) were recorded. Apoptotic index of the embryos was determined by TUNEL. Data were analyzed with ANOVA and Chi-square test with 5% of significance level. There was no effect on fusion rates (p>0.05). Embryos reconstructed with PCD cells had lower cleavage and blastocyst rates (72.7 and 18.8%, respectively) compared with embryos reconstructed with Live cells (83.4 and 34.7%, respectively; p<0.05). Apoptotic index in embryos produced from cells in PCD was similar compared to embryos produced from Live and Control cells (p>0.05). Pregnancy rates were similar between cloned groups on day 30 after embryo transfer (p>0.05). However it was observed a reduced pregnancy loss in PCD group on day 60 (25%) compared with Control (62.5%) and Live (100%) groups. Only one calf, from PCD cells (4.5% of the transferred embryos), has been obtained in this experiment. In conclusion, it was showed that cells in PCD process can be reprogrammed when used as nuclear donors after NT producing even live animals. However, a negative effect on embryonic development and an increase in the apoptotic index of these embryos was observed.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.

A transição materno-embrionária é um fenômeno complexo caracterizado pela iniciação da transcrição no embrião e a substituição do mRNA materno pelo mRNA embrionário. O mRNA e as proteínas estocadas no oócito são utilizados nas primeiras clivagens e, posteriormente, o embrião deve iniciar a transcrição dos genes necessários ao seu desenvolvimento, que ocorre no estádio de oito células em embriões bovinos. Nesta etapa, podem ser observados embriões competentes a continuar o desenvolvimento, enquanto embriões incompetentes sofrem bloqueio. Pelo fato do bloqueio ocorrer na fase de ativação do genoma embrionário, formulou-se a hipótese de que o bloqueio estaria associado a genes transcritos neste momento, contrariamente à hipótese mais aceita de bloqueio passivo. O objetivo deste trabalho foi de identificar, categorizar e avaliar transcritos diferencialmente expressos entre embriões bovinos de desenvolvimento rápido e lento, além de elucidar possíveis vias de sinalização de morte ou sobrevivência celular. Para isso, foi feita uma hibridação em membrana de macro arranjo contendo genes humanos relacionados a ciclo celular, hibridada com aRNA marcado radioativamente oriundo de embriões bovinos produzidos in vitro de acordo com sua velocidade de desenvolvimento, seguido por RT-PCR e análise de vias de sinalização para validação da hibridação. A média de similaridade entre estes genes humanos e bovinos de 89,3%. Pelas membranas de macro arranjos foram identificados 120 genes com modulação diferencial entre embriões lentos e rápidos, sendo 100 genes com regulação superior nos embriões lentos. Entre os genes com modulação positiva nos embriões rápidos, 40% foram primariamente identificados como ligantes a proteínas e 25% têm atividade catalítica, com resultados similares no grupo de genes com modulação positiva nos embriões lentos. Por um lado, as diferenças de transcrição entre embriões de desenvolvimento rápido e lento não foram confirmadas pelo RTPCR. Mas os genes diferencialmente modulados estão associados e constitutivamente presentes em algumas vias de sinalização para morte celular. Os resultados sugerem que a ativação do genoma embrionário é necessária para a sinalização de vias de sobrevivência ou morte celular programada. Assim, o bloqueio do desenvolvimento não é um processo passivo, mas sim um processo ativo de transcrição de genes, ativando tanto a cascata de sobrevivência quanto a cascata de morte em embriões com baixo potencial de desenvolvimento. / Maternal-zygotic transition is a complex phenomenon characterized by the initiation of transcription in the embryo and the transition of maternal mRNA with embryonic mRNA. It is believed that the mRNAs and proteins synthethized by the oocyte during its growth and final maturation allow the zygote to develop during the early stages of embryo development up to the 8 cell-stage, the moment when the bovine embryo acquires transcriptional competence. Competent embryos are able to develop until blastocyst, while incompetent embryos block. Since the blockage occurs during embryo genome activation, we developed the hypothesis that gene transcription in incompetent embryos is associated with the blockage, instead of passive blockage. The aim of this work was to identify, categorize and analyze gene expression differences between fast cleavage and slow cleavage embryos, and discover possible signaling pathways to cell death or cell survival. We used a macroarray membrane spotted with human genes related to cell cycle and hybridizated with a radioactive labeled aRNA from fast or slow in vitro produced embryos. Real-time PCR and signaling pathways analysis were designed for further validation of the array. The mean similarity between human and bovine genes was 89,3%. According to the array membranes, it was possible to identify 120 genes differentially expressed between slow and fast cleavage embryos. Hence, the majority of the genes were more expressed in slow embryos (100 genes versus 20 genes in fast group). Among genes more expressed at fast embryos, 40% were identified as protein binding and 25% have catalytic activity, with similar results in slow embryos. In one hand, differences between fast and slow embryos transcripts were not confirmed by real-time PCR analysis. But on the other hand, the differentially expressed genes are somehow related to and constitutively present in some recognized death pathways. Together, these results presented herein suggest that embryonic genome activation is necessary for survival or cell death signaling. Moreover, developmental block is not a passive pathway, but rather a very active transcriptional pathway, leading to activation of cell survival genes prior to genes related to death in slow-developing embryos.

Diversos tipos celulares nas mais variadas condições têm sido usados como doadores de núcleo para a TN. Ainda não está claro se o estado fisiológico destas células afeta o posterior desenvolvimento dos embriões. Neste trabalho, testou-se a hipóese que fibroblastos bovinos em processo de MCP podem ser reprogramados na transferência nuclear. Fibroblastos foram cultivados até atingirem 60% de confluência, sincronizados por restrição de soro durante 24h e em seguida a MCP foi analisada por citometria de fluxo com a ténica da Anexina V/Iodeto de propídeo. Células Anexina positivas (MCP) e Anexinanegativas (Vivas) foram separadas por citometria de fluxo e utilizadas para a TNS. Céulas não coradas e não separadas no citômetro serviram como controle (Controle). Os embriões reconstruídos foram avaliados quanto à fusão, clivagem (2º dia de cultivo), blastocisto (7º dia) e prenhez (D30, D60 e nascimento). O índice de MCP dos blastocistos obtidos foi determinado. Os resultados foram analisados pela ANOVA ou teste de X2 com nível de significância de 5%. Não houve efeito nas taxas de fusão (p>0,05). Embriões reconstruídos com células MCP tiveram menor taxa de clivagem e formação de blastocistos (72,7% e 18,8%, respectivamente) em comparação ao grupo reconstruído com células Vivas (83,4% e 34,7%, respectivamente; p<0,05), não diferindo dos embriões Controle (77,3% e 27,3%, respectivamente; p>0,05). O índice de MCP do grupo de embriões MCP foi similar aos índices dos embriões clonados a partir de células Vivas e Controle (p>0,05). Após a transferência para receptoras, os grupos MCP, Vivas e Controle não diferiram com relação à taxa de prenhez aos 30d (18,1%, 13,3% e 27,5%, respectivamente; p>0,05). Entretanto aos 60d, a perda gestacional no grupo MCP (25%) foi inferior a do grupo Vivas (100%) e Controle (62,5%). Somente um nascimento, do grupo MCP (4,5% dos embriões transferidos), foi obtido no experimento. Conclui-se que células em processo de MCP, podem ser reprogramadas quando utilizadas como doadoras de núcleo na técnica de transferência nuclear, podendo estabelecer gestações e nascimentos, entretanto houve um efeito prejudicial nas taxas de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto assim como houve aumento do índice de MCP nos embriões reconstruídos. / It is not clear if the physiological status of the cells can affect further embryonic development in NT. We hypothesized that adult bovine fibroblasts in PCD can be reprogrammed when used as nuclear donors for cloning. Fibroblasts were cultivated until 60% confluency, synchronized by serum starvation for 24 h and stained with Annexin V and Propidium iodide (PI) by flow citometry. Annexin positive cells (PCD cells) and Annexin negative cells (Live cells) were sorted and used for NT. Unsorted, unstained cells were used as control (Control cells). After reconstruction, fusion, cleavage (day 2 of culture), blastocyst (day 7) and pregnancy rates (day 30, 60 and birth) were recorded. Apoptotic index of the embryos was determined by TUNEL. Data were analyzed with ANOVA and Chi-square test with 5% of significance level. There was no effect on fusion rates (p>0.05). Embryos reconstructed with PCD cells had lower cleavage and blastocyst rates (72.7 and 18.8%, respectively) compared with embryos reconstructed with Live cells (83.4 and 34.7%, respectively; p<0.05). Apoptotic index in embryos produced from cells in PCD was similar compared to embryos produced from Live and Control cells (p>0.05). Pregnancy rates were similar between cloned groups on day 30 after embryo transfer (p>0.05). However it was observed a reduced pregnancy loss in PCD group on day 60 (25%) compared with Control (62.5%) and Live (100%) groups. Only one calf, from PCD cells (4.5% of the transferred embryos), has been obtained in this experiment. In conclusion, it was showed that cells in PCD process can be reprogrammed when used as nuclear donors after NT producing even live animals. However, a negative effect on embryonic development and an increase in the apoptotic index of these embryos was observed.

O exercício físico intenso está associado à mudanças na quantidade, na função e na morte de neutrófilos. Tem sido proposto que a suplementação com óleo de peixe minimiza os efeitos imunossupressivos do exercício físico e que a fosfatidilcolina também poderia exercer importantes efeitos sobre a função de leucócitos. O objetivo do estudo foi o de investigar os efeitos da meia maratona e da suplementação com lecitina de soja ou óleos de peixe ricos em EPA ou DHA na apoptose de neutrófilos de atletas amadores. Quarenta e seis atletas amadores, foram avaliados antes e após duas competições de meia maratona. Na primeira meia maratona, os atletas não foram suplementados. As coletas de sangue dos atletas foram realizadas nas seguintes condições: Em repouso e imediatamente após a competição. No primeiro dia, após a primeira meia maratona, iniciou-se a suplementação. Os indivíduos foram suplementados diariamente com 3g de óleo de peixe ou lecitina de soja, por 60 dias, e divididos em 3 grupos: 1) Lecitina, 2) DHA e 3) EPA. Os atletas foram reavaliados 8 semanas após o início da suplementação. Já na segunda meia maratona, com todos os atletas suplementados, as coletas de sangue foram realizadas nas mesmas condições da primeira corrida. Neste estudo avaliamos os receptores da apoptose de neutrófilos (Fas e TRAIL), as moléculas de adesão (L-selectina e ICAM-1), a fragmentação de DNA e a externalização de fosfatidilserina. Além disso, foi avaliada a concentração plasmática das citocinas TNF-alfa, IL-8, IL-6, IL-4, IL-10 e IL-1beta. As enzimas creatina quinase e lactato desidrogenase, a concentração de mioglobina, proteína C reativa e o número de leucócitos e neutrófilos também foi determinada. A meia maratona aumentou a atividade das enzimas CK e LDH e a concentração de mioglobina em todos os grupos estudados, sendo que a suplementação não apresentou nenhum efeito sobre estes parâmetros. Já o número de neutrófilos e leucócitos, aumentaram após a meia maratona em todos os grupos, e a suplementação provocou este aumento somente nos grupos EPA e Lecitina. Em neutrófilos de atletas, a meia maratona diminuiu a expressão dos receptores Fas e TRAIL e das móleculas de adesão ICAM-1 e L-selectina em todos os grupos, por outro lado, aumentou a fragmentação de DNA (somente no grupo DHA) e a externalização de FS (DHA, EPA e Lectina). A meia maratona também elevou a concentração das citocinas IL-8, IL-6 e IL-10 em todos os grupos. Já a suplementação (DHA, EPA ou lecitina de soja) diminuiu a fragmentação de DNA e a expressão do receptor Fas em neutrófilos. Além disso, aumentou a expressão de TRAIL, ICAM-1, L-selectina e a externalização de fosfatidilserina. Em relação a concentração plasmática de citocinas a suplementação reduziu a concentração de TNF-alfa e aumentou a de IL-10 em todos os grupos. Enquanto que, a concentração de IL-4 aumentou somente nos grupos DHA e EPA. Concluímos que a suplementação com lecitina de soja apresenta efeitos semelhantes aos dos óleos de peixe ricos em EPA ou DHA sobre a função de leucócitos em atletas amadores. / Intense physical exercise is associated with changes in the number, function and death of neutrophils. It has been proposed that supplementation with fish oil rich minimizes the immunosuppressive effects induced by intense physical exercise and phosphatidylcholine could also have significant effects on leukocytes function. The aim of this study was to investigate the effects of a half-marathon and fish oil suplemmentation rich in EPA or DHA or soy lecithin suplemmentation on neutrophils apoptosis of amateur athletes. Forty-six recreational athletes were evaluated before and after two half marathons. In the first competition the athletes did not receive supplementation. Blood samples were collected in the following conditions: In rest and immediately after competition. On the first day, after the first half-marathon, supplementation began. The subjects were supplemented with 3 g of fish oil or soy lecithin daily for 60 days and divided into 3 groups: 1) Lecithin 2) DHA 3) EPA. The athletes were assessed 8 weeks after the start of supplementation. In the second half-marathon, with all the supplemented athletes, blood samples were collected under the same conditions of the first competition. In this study were evaluated the receptors of neutrophils apoptosis (Fas and TRAIL), adhesion molecules (L-selectin and ICAM-1), DNA fragmentation and phosphatidylserine externalization. Moreover, the plasma concentration of TNF-alpha, IL-8, IL-6, IL-4, IL-10 and IL-1beta cytokines was evaluated. The enzymatic activity of creatine kinase and lactate dehydrogenase, plasma concentration of myoglobin, and C-reactive protein and blood counts was also determined. The half-marathon increased the enzymatic activity of CK and LDH and the myoglobin concentration in all groups studied, and the supplementation had no effect on these parameters. The number of neutrophils and leucocytes increased in all groups after half marathon, and the supplementation caused this increase only in the EPA and Lecithin groups. In athletes neutrophils, the half-marathon decreased the expression of Fas and TRAIL receptors and of ICAM-1 and L-selectin adhesion molecules. On the other hand, it increased DNA fragmentation (only in the DHA group) and phosphatidylserine externalization (DHA, EPA and Lecithin groups). The half-marathon also increased concentrations of IL-8, IL-6 and IL-10 cytokines in all groups. The Supplementation (DHA or EPA or soy lecithin) decreased DNA fragmentation and Fas receptor expression in neutrophils. Moreover, increased expression of TRAIL, ICAM-1, L-selectin and phosphatidylserine externalization. In relation to cytokines plasma concentration the supplementation decreased TNF-alfa and increased the concentration of IL-10 in all groups. Whereas, IL-4 concentration increased only DHA and EPA groups. In conclusion, supplementation with soy lecithin has similar effects to the fish oils rich in EPA or DHA on leukocyte function amateur athletes.

A resistência das paredes celulares vegetais à hidrólise enzimática é um dos grandes gargalos tecnológicos para a obtenção do etanol celulósico. Acredita-se que as modificações nas paredes celulares em processos como a mobilização de reservas, formação de aerênquima, amadurecimento de frutos e senescência, por exemplo, envolvam a ativação de módulos funcionais que culminam em alterações nas paredes celulares. Estes módulos são: 1) recepção de um sinal para início do processo; 2) Morte Celular Programada (PCD); 3) separação celular; 4) expansão celular; 5) hidrólise de hemiceluloses e 6) hidrólise de celulose. No caso da formação de aerênquimas lisígenos o processo que se inicia com a PCD e é seguido pela liberação de glicosil hidrolases que atuam a na degradação e/ou modificação da parede celular, formando espaços de ar no córtex radicular. A formação de aerênquima nas raízes de cana de açúcar é constitutiva e pouco se sabe sobre os mecanismos de modificação que ocorrem na parede celular durante este processo. Este estudo buscou compreender os padrões de variação expressão gênica, proteínas e de atividades enzimáticas associados à formação do aerênquima em raízes de cana de açúcar, com ênfase no papel das hidrolases de parede celular e em algumas proteínas relacionadas à PCD. Foram utilizados 5 segmentos de raízes de 1 cm cada, a partir do ápice radicular. No material coletado observou-se a formação gradual de aerênquima. Foram realizadas análises transcricional, proteômica e atividade enzimática das glicosil hidrolases e outras proteínas que atuam na modificação da parede celular, os quais foram identificados e quantificados ao longo da formação do aerênquima. As glicosil hidrolases pertencentes às famílias Cazy GH1, GH3, GH17, GH18 bem como expansinas, celulose sintase, lacase, calreticulina, calmodulina e proteínas relacionadas a degradação de pectinas, foram encontradas ao longo dos segmentos, principalmente após o segmento 2. De acordo com a atividade transcricional e dados da proteômica, sugere-se que os polissacarídeos seriam atacados por enzimas nos estágios iniciais da formação do aerênquima (seg 2 e 3). O ataque ocorre principalmente sobre as pectinas e o &beta;-glucano. Contudo, os dados apontam para a deposição de xiloglucano, xilanos e celulose (após seg 3), que formam um compósito ao redor dos espaços de ar. Isto sugere que parte dos polissacarídeos das paredes não sejam degradados ao longo do processo, embora enzimas específicas detectadas possam atuar na modificação dos mesmos, como verificado para algumas pectinases e membros de GH17. Além disso, nos pré-tratamentos com água foi possível observar que há maior sacarificação da parede nos seg. 1 e 2. Contudo quando retira-se a maior parte das pectinas e hemiceluloses após pré-tratamento com NaOH, a sacarificação é maior nos segmentos 2, 3 e 4, devido ao maior acesso e a maior quantidade de celulose. As glicosil hidrolases encontradas neste trabalho sugerem que estas atacam a parede de um específico conjunto de células do córtex que dá origem ao aerênquima. Já no fim do processo, quando há lise celular, algumas paredes de células remanescentes são recalcitrante à hidrólise, provavelmente devido a sua arquitetura e composição. Este trabalho traz informações para o desenvolvimento de futuras tecnologias para a produção do etanol do etanol celulósico de cana-de-açúcar / The resistance of plant cell walls to enzymatic hydrolysis is one of the main bottlenecks of the development of technology of production of cellulosic ethanol. It is believed that the modifications in cell walls related to processes of storage mobilization, aerenchyma formation, fruit ripening and senescence, for instance, involve the activation of functional moduli that culminate in alterations of cell walls. These moduli are: 1) signal perception to start the process; 2) Programmed Cell Death (PCD); 3) cell separation; 4) cell expansion; 5) hydrolysis of hemicelluloses and 6) hydrolysis of cellulose. In the case of the formation of lysigenous aerenchyma, the process starts with PCD and is followed by the release of glycosil hydrolases that act on the degradation and/or cell wall modifications, forming air spaces in the cortex of the root. The formation of aerenchyma in the roots of sugarcane is a constitutive phenomenon and little is known about the mechanisms of modification that occur in cell walls during its development. Thus, the present study focused on the visualization of the patterns of variation of gene expression, proteins and enzyme activities associated to the formation of aerenchyma in roots of sugarcane in order to understand the role of the cell wall hydrolases and some proteins related to PCD in cell wall modifications along the process. Five root segments of 1cm each, starting from root apex, were used. A gradual centripetal formation of aerenchyma was recorded in the cortex of developing roots. Analyses of the transcriptional, proteomic and enzyme activity profiles during the process revealed that several enzymes act on cell wall modifications. The glycosil hydrolases belonging to the Cazy families GH1. GH3, GH17, GH18, as well as expansins, cellulose synthase, laccase, calreticulin, calmodulin and other proteins related to pectin degradation have been found along the segments, mainly after segment 2. According to the data on transcriptomics and proteomics, it is suggested that enzymes attack polysaccharides during the initial stages of aerenchyma formation (seg. 2 and 3). The attack of the enzymes occurs mainly on pectins and &beta;-glucan. Conversely, the data point out to the deposition (or maintenance) of xyloglucan, xylan and cellulose (after seg. 3), which form a composite that surrounds the air spaces. This suggests that part of the polysaccharides present in cell walls are not degraded during the process, although specific enzymes have been detected that could act on polysaccharide mobilization, such as the GH17 family. Further, under pretreatment with water, it has been observed that cell wall saccharification was higher at segments 1 and 2. On the other hand, when most of the pectins and hemicelluloses are retrieved by pretreatment with NaOH, saccharification is higher of segments 2, 3 and 4, probably due to the higher access to the wall and also to the higher proportion of cellulose. The profiles related to the glycosil hydrolases found in this work, suggest that these enzymes attack the cell wall. Initially, they are probably kept within a group of cells that will originate the aerenchyma. At the end of the process, when there is cell lysis, the remaining walls of some cells are recalcitrant to hydrolysis probably due to changes in their architecture and composition. Our findings bring promising information that could be used in the future to improve efficiency of hydrolysis for cellulosic ethanol production from sugarcane

A técnica de cultura de tecidos permite a propagação rápida e maciça de propágulos geneticamente semelhantes, isentos de doenças, sendo amplamente empregada para a obtenção de gemas adventícias e embriões somáticos visando principalmente, a multiplicação clonal sob ação de reguladores de crescimento. Resultados satisfatórios foram obtidos com a espécie Bactris gasipaes Kunth. por meio da regeneração direta de gemas adventícias e de embriões somáticos, no entanto, as consequências decorrentes da prolongada manutenção in vitro de espécies perenes como a pupunheira, não estão elucidadas, sendo que as pesquisas mais expressivas ocorrem com espécies anuais e restritas a órgãos específicos. Considerando que o tempo de cultivo pode promover a senescência e a habituação de determinados tecidos aos reguladores de crescimento, afetando consideravelmente o potencial morfogênico, o objetivo principal do presente trabalho foi investigar a ocorrência destes processos em folhas, raízes e bases caulinares de plântulas e microplantas com um e oito anos de cultivo, respectivamente. Para tanto, o processo de senescência foi monitorado por meio de análises histológicas, ultraestruturais e histoquímicas à detecção de substâncias ergásticas e à fragmentação do DNA, ao passo que o processo de habituação, foi monitorado por meio de análises morfofisiológicas, histológicas e histoquímicas. Os resultados pertinentes ao processo de senescência evidenciaram a ocorrência de intenso processo de morte celular programada nas células de diversos tecidos nas estruturas analisadas das microplantas, sendo que estes eventos foram escassos e limitados às bases caulinares nas plântulas. Além disso, foi observada a presença elevada de plastoglóbulos no interior dos cloroplastos e de compostos fenólicos nas estruturas foliares e radiculares das microplantas. Já, em relação aos resultados obtidos à detecção do processo de habituação nestas microplantas, quando comparados às plântulas, foram detectados problemas relacionados ao alongamento da parte aérea e do sistema radicular, bem como alterações morfológicas nas raízes e uma pronunciada redução no potencial morfogênico das células pré-procambiais em relação às plântulas. Estes resultados evidenciam que a manutenção in vitro de pupunheiras por longos períodos promoveu o envelhecimento dos propágulos em decorrência à senescência generalizada, bem como provavelmente os conduziu ao processo de habituação aos reguladores de crescimento ANA e/ou BAP, inviabilizando a propagação em grande escala desta espécie. / The tissue culture technique allows rapid and massive spread of propagules genetically similar, free from diseases, being the technique widely employed to obtain adventitious buds and somatic embryos mainly targeting the clonal multiplication under the action of growth regulators. Satisfactory results have been obtained with the specie Bactris gasipaes Kunth. through direct regeneration of adventitious buds and somatic embryos, however, the consequences from prolonged in vitro maintenance of perennial species such as peach palm are not clear, and the most significant research occur with annual species and restricted to specific organs. Whereas the cultivation time can promote senescence and habituation of certain tissues to the growth regulators, affecting considerably the morphogenic potential, the main objective of this study was to investigate the occurrence of these processes in leaves, roots and stem bases of seedlings and microplants with one and eight years of cultivation, respectively. Thus, the senescence process was monitored by histological, ultrastructural and histochemical detection of ergastic substances and DNA fragmentation, whereas the habituation process was monitored by analyses histologic, histochemic and morpho-physiological. The relevant results from the senescence process showed the occurrence of an intensive process of programmed cell death in cells of various tissues of the analised microplants structures, and these events were rare and limited to the stem bases in the seedlings. Furthermore, it was observed the high presence of plastoglobules inside chloroplast and phenolic compounds in the leaf and root structure of microplants. Already, the results obtained in relation to the detection of the habituation process in these microplants, when compared to the seedlings, were detected problems related to the elongation of shoots and roots, as well as morphological changes in roots and a pronounced reduction in the morphogenic potential of pre procambial cells compared to seedlings. These results demonstrate that the in vitro maintenance of peach palm for long periods promoted the aging of seedlings due to senescence widespread and probably led to the habituation process, to the growth regulators NAA and/or BAP, difficulting the propagation on a large scale of this species.