A membrana amniótica (MA) é considerada um biomaterial com propriedades biológicas benéficas ao processo de reparação tecidual, servindo ao tratamento de feridas e queimaduras. Recentemente, tem sido usada como substrato para a construção de substitutos cutâneos, possibilitando o cultivo de queratinócitos humanos. Contudo, por se tratar de um material biológico, com risco de transmissão de doenças infectocontagiosas, necessita ser conservado e esterilizado antes de seu uso clínico. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da radiação ionizante sobre membranas amnióticas gliceroladas, com ênfase em sua compatibilidade ao cultivo de queratinócitos humanos. Quatro MA foram conservadas em altas concentrações de glicerol (>85%), sendo metade delas enviadas para radioesterilização a 25 kGy. Constituíram-se dois grupos de estudo: MA não irradiadas (MA-ni) e MA irradiadas (MA-i). Ambos os grupos foram submetidos a protocolo padronizado de desepitelização e avaliados por microscopia óptica (Hematoxilina-eosina e Picrossirius), imunofluorescência para colágeno IV e laminina e microscopia eletrônica. Posteriormente, foram cultivados queratinócitos humanos sobre as superfícies desepitelizadas das bases de MA-ni e MA-i em situação imersa e em interface ar-líquido. Foram comparados os resultados nos instantes 14 e 21 dias de cultivo, por microscopia óptica e eletrônica. As análises microscópicas, após a denudação epitelial, demonstraram que no grupo não irradiado a continuidade da membrana basal encontrava-se preservada, enquanto no grupo irradiado não existia nenhum indício de resquício da presença da membrana basal na superfície do material. O resultado das culturas de queratinócitos mostrou que no grupo não irradiado houve crescimento de um epitélio multiestratificado e diferenciado, inclusive com a formação de estrato córneo na situação de interface ar-líquido. No grupo irradiado, o epitélio formado era composto por duas a três camadas de estratificação e discreta diferenciação celular, com semelhanças entre o cultivo imerso ou em exposição ao ar. A MA glicerolada foi compatível ao crescimento de epitélios cultivados, demonstrando potencial ao uso como um possível substituto dermoepidérmico. A irradiação a 25 kGy provocou danos estruturais às MA, levando a alterações na membrana basal e facilitando a sua perda quando exposta ao protocolo de desepitelização. Esta perda pode explicar a diferença nos resultados do cultivo de queratinócitos em MA-i em relação ao MA-ni / The amniotic membrane (AM) is a biomaterial with biological properties that are beneficial to tissue repair. It has been used as a temporary coverage to threat burns and chronic wounds. Recently, it has been served as a substrate for keratinocytes culture to construct a living skin equivalent. However, MA is a biological material, and its transplantation could cause infectious disease for receptors. So, it must be preserved and sterilized before clinical use. The aim of this study was to evaluate the radiation effects on glycerol-preserved MA, considering its compatibility to support human keratinocytes culture. Four MA were stored in high concentrations of glycerol (> 85%) and half of them were radio sterilized with a dose of 25 kGy. Then, we established two groups: non-irradiated MA (MA-ni) and irradiated MA (MA-i). Both groups was de-epithelialized by a standardized protocol and was investigated morphologically, immunohistochemical and ultraestructural. Subsequently human keratinocytes were cultivated immersed and in air-liquid interface on denuded surface of MA-i and MA-ni. The results were compared at 14 and 21 days of culture by light and electron microscopy. After epithelial denudation, analyses demonstrated the continuity of the basement membrane in MA-ni group, whereas in the irradiated group, there was no indication of the basement membranes presence on the surface of MA. The cell cultures showed that in the non-irradiated group, there was growth of a multi-layered and differentiated epithelium, with a stratum corneums formation in air-liquid interface. In the irradiated group, the epithelium had only two or three layer, little cell differentiation, with the same results immersed or air-liquid interface system. Glycerol-preserved MA was biocompatible with the growth of a cultivated epithelium, showing its potential as a skin substitute. Irradiation at 25 kGy cause structural damage to the tissue, making changes in basement membrane, that facilitates its loss when exposed to the de-epithelialized protocol. The basement membranes loss may explain the difference between the keratinocytes cultivation on MA-I and MA-ni
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24052011-143235 |
| Date | 21 February 2011 |
| Creators | Paggiaro, André Oliveira |
| Contributors | Mathor, Monica Beatriz |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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