Orientador: Roberto Zatz / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T06:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fajardo_MichelleIndiraArcos_M.pdf: 1650020 bytes, checksum: be76faba64dfbca0a9ad19977f81a84b (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: A inibição crônica do óxido nítrico (NO) leva ao desenvolvimento de hipertensão arterial, lesão renal isquêmica e glomeruloesderose. A administração concomitante de Uma dieta hipersódica leva ao desenvolvimento de albuminúria maciça. Nós investigamos os mecanismos responsáveis por esse aumento de permeabilidade glomerular a macromoléculas.Ratos Munich Wistar machos e adultos receberam dietas padrão (NS) ou hipersódica (HS) e associado ou não à administração de um inibido r específico da síntese de óxido nítrico, o Nw Nitro-L-Arginina-Metil Ester (L-NAME), via oral a 70 mgjKgj dia. Após 15 e 30 dias medimos: a °albuminúria (UalbV, mgj min), a pressão arterial média (P AM, mmHg), o clearance de inulina (Ci, mIj min), o de dextran (Cd, mIj min) e o clearance fracional de dextran (8=Ci/Cd). Investigamos também a densidade de cargas aniônicas da membrana basal glomerular (MBG), perfundindo o rim com uma solução contendo ferritina catiônica e quantificando a porcentagem de depósitos de ferritina em micrografias eletrônica de glomérulos. N ossos resultados sugerem que a inibiç'ão crônica do NO quando associada a sobrecarga salina aumenta a permeabilidade glomerular através de: (1) um defeito na restrição por tamanho à filtração de macromoléculas; (2) perda da barreira eletrostática glomerular. Observamos também que 30 dias após interrupção dos tratamentos ocorre reversão dessas alterações / Abstract: We have previously described that chronic nitric oxide (NO) inhibition leads to progressive systemic hypertension and renal structural injury. Concomitant dietary salt overload and NO blockade lead to the development of massive albuminuria. Here we investigated the mechanism whereby these treatments increase the glomerular permeability to macromolecules. Adult male Munich Wistar rats were given standard-salt (55, 0.5% Na) or high salt (H5, 3.12% Na) diet and received either no treatment or the NO inhibitor Nco-L-nitroarginine metilester (NAME), 70 mg/kgl day in drinking water. At 15 and 30 days albuminuria (UalbV, mg/min), inulin clearance (Cin, mI/min), mean arterial pressure (MAP, mmHg), neutral dextran clearance (Cd, mIl min) and the fractional neutral dextran clearance (8= Cinl Cd) were measure,d. The density of fixed anionic sites at glomerular basement membrane (GBM) was also estimated by a point-counting technique, after renal perfusion with a solution containing cationic ferritin. The results suggest that chronic NO inhibition combined with H5 enhances the permeability of the glomerulus by : (1) impairing its size selectivity (by direct wall injury); (2) impairing especialIy its charge selectivity. We also observed that 30 days after the interruption of treatments all these alterations were reverted. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências

Orientador: Humberto Santo Neto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-25T21:07:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luz_DjaniraAparecidada_M.pdf: 10076168 bytes, checksum: bfb65835c1fee9b7b2746e42965e9c75 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Seguindo-se a secção ou esmagamento de um nervo periférico, a porção distal à lesão sofre degeneração. Havendo condições apropriadas ocorre regeneração axonal e as fibras musculares são reinervadas pelos axônios regenerados. Em anfíbios, está estabelecido que cerca de 95% das fibras musculares são reinervadas em seus antigos sítios neuromusculares. Diversos estudos têm demonstrado que mo!éculas que compõem a lâmina basal da fibra muscular, no nível da junção neuromuscular, são fatores trópicos decisivos para essa seletividade. Contudo, o quanto areinervação em mam íferos ocorre com a mesma precisão ainda não foi efetivamente demonstrado. o objetivo deste trabalho foi estudar o quanto a membrana basal juncional influencia na redistribuição topográfica das junções neuromusculares em fibras musculares regeneradas. Para isto, realizamos autotransplantes cruzados livres entre os músculos sóleo e extensor longo dos dedos, não aquecidos e aquecidos. Os animais foram sacrificados, no período entre 95 e 130 dias após a cirurgia. Os músculos retirados foram imediatamente fixados em solução de Karnovsky e após a fixação, os sítios colinérgicos foram marcados com técnica histoquímica e a redistribuição das junções neuromusculares analisadas ao microscópio de luz. Em seguida, estes músculos foram lavados e seccionados transversalmente para técnica histológica. Nossos resultados demonstram que durante a reinervação muscular, os axônios em regeneração ocuparam especialmente os sítios sinápticos originais, sugerindo que os componentes associados à membrana basal juncional promovam a diferenciação e o crescimento dos terminais motores na direção dos antigos sítios sinápticos / Abstract: After the section or crushing of a peripheral nerve the distal portion to the lesion degenerates. When there are adequate conditions axonal regeneration occurs and the muscle fibers are reinnervated by the regenerated axons. In amphibians it is said that 95% of the muscle fibers are reinnervated in their neuromuscular sites. Many studies have demonstrated that molecules of the synaptic basal lamina play a central role for this selectivity. Neverthless whether the reinnervation in mammals occurs with the same accuracy has not effectively been demonstrated. The aim of the present was to study in Wistar rat how the integrity of junctional basal lamina influences the topographic redistribution of new neuromuscular junctions in reinnervated muscle fibers. For this we made crossed autotransplant between the soleus and extensor digitorium longus rat muscles, not heated and pre-heated which show neuromuscular junctions distributed in different places and for having been taken from its original beds the muscles were denervated. The animais were sacrificed 130 days after the surgery. The muscles which have been taken out were immediately fixed in Karnovsky's solution and after fixing the colinergic sites were marked with histochemistry technic and the redistribution of the neuromuscular junction was analysed in the light microscope. After, this muscles was washed, fixed and sections for histological technique.Our results demonstrated that during the muscular reinervation the axons grow occupy precisely at the original synaptic sites, supposed that components associated with the junctional basal lamina play role in the differentiation and the development of motors terminais in the direction at original synaptic sites / Mestrado / Anatomia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Luis Alberto Magna, JoseVassallo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T08:23:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinto_GlauceAparecida_D.pdf: 3250801 bytes, checksum: 078ddc449368d1dcaea6fc10791d0de2 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: A integridade da Membrana Basal (MB) está comprometida no processo de evolução de uma lesão benigna ou potencialmente maligna para uma lesão maligna, onde ela pode sofrer graus variados de descontinuidade como condição necessária ao processo de invasão. A imunocoloração para colágeno IV, componente encontrado exclusivamente na MB, tem sido utilizada para avaliar os padrões de apresentação da mesma em neoplasias e lesões benignas de vários órgãos. Com o objetivo de avaliar o padrão de continuidade da MB em Carcinomas "In Situ" (CIS), Microinvasivos (CMI) e Epidermóides Francamente Invasores (CEI) do colo uterino, bem como o de verificar o possível auxílio de tal expressão no diagnóstico de invasão inicial do estroma (CMI), realizou-se aqui um estudo retrospectivo em casos diagnosticados no Departamento de Anatomia Patológica da UNICAMP entre 1988 a 1993. Os casos selecionados, previamente fixados e incluídos em parafina, foram revistos (hematoxilina-eosina) e posteriormente submetidos a estudo imuno-histoquímico pelo método da avidina-biotina-peroxidase com anticorpo monoclonal produzido em camundongo anticolágeno IV (Dakopatts). Os cortes histológicos foram previamente submetidos à digestão por pepsina durante 2 horas a 37°C. Ao final da seleção foram avaliados 20 casos de CIS, 15 de CMI e 24 de CEI. Os casos de CEI mostraram evidente descontinuidade, em grau pequeno ou grande da MB (23/24 casos), mostrando apenas um caso com MB contínua e íntegra. Embora não houvesse significância estatística no padrão de continuidade da MB entre casos de CIS e CMI, houve nítida tendência destes a apresentarem pequenas interrupções (sete de 15 .casos de CMI contra apenas três de 20 casos de CIS). O infiltrado inflamatório, variável também analisada, não deveria ser responsabilizado pelas áreas de descontinuidade da MB, uma vez que não houve correlação estatística entre elas. Em 15 dos 59 casos estudados houve algum grau de discordância, quer à revisão da mortologia ou após avaliação da imunocoloração. Estes casos foram submetidos a um segundo Revisor, sendo que em oito casos a imunocoloração foi importante na decisão diagnóstica. Em outros cinco, porém, a imunocoloração mostrouse falha, pois o processo patológico analisado havia sido desbastado do bloco de parafina. Os resultados do presente trabalho sobre o padrão de continuidade da MB são compatíveis com os dados da literatura. Concluiuse que a imunocoloração para colágeno IV pode ajudar o diagnóstico de invasão inicial do estroma (CMI), contudo, a avaliação deve ser criteriosa e feita em conjunto com os dados de mortologia clássica / Abstract: Basement membrane (BM) integrity is altered when a benign or potentially malignant process changes into malignancy. In this process, it may undergo varying degress of discontinuity, as a prerequisite to tissue invasion. Immunostaining for collagen IV, present in BM solely, has been used to evaluate patterns of BM integrity in neoplasic and benign processes in severa I organs. A survey was performed, within cases diagnosed as cervix in situ (ISC), microinvasive (MIC) and invasive squamous cell carcinoma (SCC), at the Department of Pathology, State University of Campinas (São Paulo, Brazil), from 1988 t9 1993. Our purpose was to evaluate the pattern of continuity of BM amongst these cases, and to verify in which extent it could be helpful in the diagnosis of beginning stroma invasion (MIC). Specimens had been previously formalin fixed, paraffin embedded. Standard stains (H&E) were reviewed and selected blocks were submitted to immunohístochemical processlng, uSlng an avid i n-biotin-peroxi dase technique, with a mouse monoclonal anti-collagen IV antibody (Dakop,atts). Histological sections were previously treated with pepsin, in a two hour incubation period at 37°C. At the end of selection, 20 cases of ISC, 15 MIC and 24 SCC were studied. SCC cases showed evident BM disruption, one case only showing BM linear and continuous. Although no statistical difference could be demonstrated in BM pattern of integríty among ISC and MIC cases, there was a clear tendency of MIC to show small areas of discontinuity (7/15 MIC compared to 3/20 ISC). Presence of inflamatory infiltration did not seem to be responsible for BM discontinuity, because these two variables were not statistically associated. In 15 of the 59 cases studied there was some degree of diagnosis disagreement, either in reviewing H&E, ar after immunohistochemistry. These cases were submitted to a second examiner and in 8 of them immunohistochemistry was an important toei for final diagnosis. In further 5 cases, however, immunohistochemístry failed to demonstrate the lesíon, due to wasting off the paraffin blocks. Our results on pattern of BM continuity in cervix cancer are in agreement with others previously reported. We then conclude that immunohistochemistry for collagen IV may be a helpful tool for diagnosis of beginning stroma invasion (MIC), but evaluatíon must be carefully performed together with traditional morphologica l data (H & E) / Doutorado / Doutor em Anatomia Patologica

Orientador: Deilson Elgui Oliveira / Resumo: Durante processos patológicos como o câncer, a atividade migratória de células neoplásicas aumenta, sendo um passo crítico para a disseminação dessas células a órgãos distantes. O processo migratório dessas células depende da formação de protrusões citoplasmáticas chamadas invadopódios, através da nucleação e polimerização de actina e degradação da matriz extracelular (MEC). A MEC é uma rede complexa de proteínas que fornece sustentação e moléculas sinalizadoras responsáveis pela homeostase dos tecidos. Dentre essas proteínas, a fibronectina (FN) é uma glicoproteína multiadesiva fundamental no comportamento celular normal e apresenta-se aumentada no tecido tumoral. Esse trabalho teve como objetivo avaliar a influência da FN, isolada ou em associação com componentes da membrana basal, no processo migratório de células tumorais prostáticas, com ênfase no mecanismo de formação dos invadopódios. Para isso, as linhagens celulares LNCaP e PC-3 foram divididas nos seguintes grupos experimentais: Controle, FN solúvel (10µg/mL), FN coating (10µg/mL), FN+Geltrex e Geltrex com exposição aos componentes por 4 dias. Nas células LNCaP, foi possível observar alterações morfológicas dos grupos expostos a FN (solúvel, coating e em associação com Geltrex) com diminuição na área celular em comparação ao grupo controle. A proliferação celular aumentou nos grupos com recobrimento da superfície (FN coating, FN+Geltrex e Geltrex). Também foi possível observar a diminuição na taxa de motilidade dess... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During pathological processes like cancer, the migratory activity of neoplasic cells increases, being a critical step for the dissemination of these cells to distant organs. The migratory process depends on the formation of cytoplasmic protrusions called invadopodia, through actin polymerization and extracellular matrix degradation (ECM). ECM is a complex protein network that provides support and molecules responsible for tissue homeostasis. Among these proteins, fibronectin (FN) is an essential adhesive glycoprotein in normal conditions however, is unregulated in tumor tissue. The objective of this study was to evaluate the influence of FN, alone or in association with basement membrane (BM) components, within migratory process of prostatic tumor cells, with emphasis on the mechanism of invadopodia. For this, the LNCaP and PC-3 cell lines were divided into the following experimental groups: Control, FN soluble (10μg / mL), FN coating (10μg / mL), FN + Geltrex and Geltrex. Exposure time was established into 4 days. We could observe morphological alterations of the groups exposed to FN in LNCaP cells, with a decrease in the cellular area in comparison to the control group. Cell proliferation was increased in the groups with surface coating (FN coating, FN + Geltrex and Geltrex). It was also possible to observe a decrease in the motility rate of these cells in all the exposed groups. Key proteins expression important to invadopodia formation (Cortactin, Dynamin-2 and Actin-F) w... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Tese (doutorado) - Universidde Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-20T11:14:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pavin_ElizabethJoao_D.pdf: 3589509 bytes, checksum: 84c167e3a4d2d2f0430ba93886105632 (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: A excreção urinária de componentes da membrana basal, especificamente colágeno IV e laminina, foi determinada através de "immunoblotting", e estudada em ratos Wistar machos, diabéticos-induzido por drogas (aloxana e estreptozotocina) EV, e comparada a controles, em função do tempo de doença. Estudamos, também, as funções renais: glomerular e tubular, avaliando, respectivamente, clearance de creatinina e de lítio. Além disso, aspectos morfológicos renais foram analisados utilizando-se técnicas de PAS e de imuno-histoquímica, para colágeno IV e laminina, com o objetivo de verificar possíveis alterações da membrana basal. Assim, pudemos observar excreções de frações urinárias de colágeno IV (88 e 75 kDa) e laminina (108 e 88 kDa), em ambos os modelos de DM, em todos os tempos estudados. Entretanto, a fração de 57 kDa da laminina, nos animais diabéticos-induzido por estreptozotocina, somente foi expressa a partir da 5a semana de doença, enquanto nos diabéticos- induzido por aloxana sua excreção foi verificada precocemente (2º dia). As alterações da função renal foram semelhantes nos dois modelos, porém de maneira mais intensa no modelo aloxânico. Dentre elas destacaram-se: diminuição progressiva da taxa de filtração glomerular, aumento da fração de excreção de sódio; e, diminuição da reabsorção proximal deste ion, não compensada por aumento da reabsorção distai. Os achados morfológicos evidenciaram espessamento da membrana basal do capilar glomerular e aumento da matriz mesangial, iniciando-se precocemente no diabetes melliíus aloxânico. De acordo com os dados observados neste estudo, concluímos que no DM induzido por aloxana e estreptozotocina, frações urinárias de colágeno IV e laminina podem ser utilizadas como marcadores precoces de nefropatia diabética. Outrossim, o DM induzido por aloxana promove alterações funcionais renais mais intensas, principalmente tubulares, quando comparado ao modelo induzido por estreptozotocina; em adição, as alterações morfológicas observadas pela técnica de imuno-histoquímica puderam ser correlacionadas às alterações bioquímico-funcionais-renais / Abstract: The urine excretion of basement membrane components, specifically collagen IV and laminin, was determinated by immunoblotting and analyzed in male diabetic Wistar rats diabetic-induced (alloxan and streptozotocin) and compared to controls, considering the disease period. We also studied the renal functions: glomerular and tubular, evaluating creatinine and lithium clearance, respectively Moreover morphological renal aspects were analyzed by using PAS and immunohistochemical staining, for collagen IV and laminin, with the purpose of examining possible alterations at the basement membrane. In this way, we could observe urine fractions excretions of collagen IV (88, 75 kDa) and laminin (108, 88 kDa), in both DM models, in all periods of study. However the laminin fraction of 57 kDa, in the streptozotocin-induced diabetic animals, was expressed only from the 5th week of the disease, while in the alloxan-induced diabetic animals their excretion was verified earlier (on the 2nd. day). The renal function alterations were similar in the two models, but with more intensity in the alloxan model. Among them we can underline following; progressive decrease of the glomerular filtration rate, increase of the fractional sodium excretion and decrease of the proximal reabsorption of this ion, not compensated by distal reabsorption increase. The morphological findings showed a thickness of the capilar glomerular basement membrane and an increase of the mesangial matrix, beginning earlier at the alloxanic diabetes mellUus. In accordance with the data observed in this study, we conclude that at the alloxan and streptozotocin induced DM, urine fractions of collagen IV and laminin can be used as early markers of diabetic nephropathy. Besides this, the alloxan-induced DM produces functional renal alterations with more intensity, mainly tubular, when compared to the streptozotocin-induced model; in addition, the morphological alterations observed by the immunohistochemical technic could be related to the renal biochemical- functional alterations / Doutorado / Medicina Interna / Doutor em Ciências Médicas

Orientadores: Ricardo de Lima Zollner, Jose Vassallo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-19T15:11:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zantut-Wittmann_DeniseEngelbrecht_D.pdf: 4801105 bytes, checksum: ea1e7d96c898af34bc498dbacdc9b3c8 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: O trabalho teve o intuito de estudar aspectos séricos e morfológicos na relação entre a membrana basal do folículo tiroideano e doença tiroideana auto-imune, procurando elementos que possam acrescentar subsidios para o entendimento de sua fisiopatologia. O estudo sorológico de pacientes com diversas alterações tiroideanas foi realizado através de eletroforese de transferência seguida de "immunoblot", com a finalidade de detectar anticorpos anticolágeno IV e antil~rninina, dois dos elementos principais da membrana basal. Tal procedimento possibilitou a detecção de anticorpos reativos a várias frações do colágeno IV encontrados apenas na doença de Basedow-Graves. Da mesma forma, esta especificidade pôde ser verificada para os anticorpos antilarninina existentes nos soros destes pacientes, através do reconhecimento da fração reativa de 57 kDa da estrutura da larninina. . Estes anticorpos estariam envolvidos na fisiopatologia dos mecanismos auto-imunes da doença tiroideana e não somente com o estado hipermetabólico devido à tirotoxicose, pois não ocorreram em hipertiroidismo de origem tumoral benigna. Assim, o estudo morfológico através de imuno-histoquimica, especificamente do colágeno IV e laminina J poderia elucidar alguns aspectos sobre a existência de anormalidades da membrana basal folicular na doença tiroideana auto-imune. Entretanto, não houve a demonstração de alterações importantes da membrana tanto na doença de Basedow-Graves quanto na tiroidite de Hashimoto, especialmente interrupção, inclusive em áreas de intenso infiltrado linfoplasmocitário. Foram vis11:1117.ados locais de adelgaçamento da membrana, sobretudo na doença de Graves, talvez flutos do hipermetabolismo, que liberaria colágeno IV e Jarn1n1na para a circulação, e conseqüentemente, induziria a produção de seus respectivos anticorpos.Desta forma, o anticorpo anticolágeno N poderia tratar¬se não apenas de reflexo do estado hipermetabólico, mas integrante do processo fisiopatológico da doença de Graves. De modo semelhante, nossos resultados sugerem que a tração de 57 kDa da laminina seja um provável marcador sorológico para a Doença de Basedow-Graves, contudo existe a necessidade da ampliação do estudo para que possamos relacioná-los ao estágio da doença / Abstract: The purpose of the present study is to evaluate serological and morphologic aspects concerning the basement membrane (BM) of the thyroid follicle in autoimmune thyroid disease (ATD). In this way, new elements for ~ better understanding of its pathophisiology could be suggested. In order to detect antibodies to collagen IV and laminin, two major components of the BM, serological tests of patients with the diagnosis of different thyroid diseases were performed by the transfer eletrophoresis method followed by immunoblot. Only in the Basedow-Graves' disease antibodies,' to various collagen IV fractions were detected. Also, antibodies to laminin were found in these patients' sera, detected by recognition of the 57 kDa fraction of laminin. These antibodies are probably involved in the pathogenesis of ATD and are not just consequence of hypermetabolic states due to hyperthyroidism, since no antibodies could be detected in thyroid hyperfunction caused by benign thyroid neoplasia. Production of such antibodies could be atributed to or cause BM alterations as a consequence of disturbed immunological tolerance to their components, which are otherwise recognized as self, and induction of immunologic response. If this is true, immunohistochemical staining of collagen IV an Iaminin could be useful in detecting follicIe BM disruption in A TD. Our results do not corroborate this hypothesis, since we were not able to find BM alterations in thyroid diseases, even in areas of heavy lymphoplasmatic inflamation. Finding of focal BM thinning, mainly in Graves' disease, could be preliminarly explained by hypermetabolism, delivery of collagen IV and laminin to the circulation and induction of antibody production against them. This hypothesis, however, is not corroborated by the findings in toxicadenoma, another cause of hyperthyroidism, in wich BM thinning is not present. In Hashimoto thyroiditis, in disagreement with previously reported data, no disruption, nor significant BM thinnin g were seen. The pathogenetic role of these antibodies is not yet clear, but it does not seem that they cause follicular BM damage. Further investigations are needed to characterize biologically such antibodies and to understand their relationship to follicular BM in A TD / Doutorado / Medicina Interna / Doutor em Ciências Médicas

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El sinciciotrofoblasto presenta una membrana apical y una membrana basal, que constituyen la principal barrera para el intercambio materno fetal. El cloruro (Cl-) es el principal ión extracelular y su paso através de la membrana apical ha sido ampliamente estudiado. Sin embargo, en la membrana basal el transporte de cloruro ha sido poco estudiado. El presente trabajo es el primero en describir las vías conductivas de cloruro existentes en la membrana basal (MB) del sinciciotrofoblasto trasplantado a ovocitos de Xenopus leavis a través del método de Voltage clamp. Al transplantar MB a ovocitos de Xenopus Laevis, estos muestran un aumento de corrientes de al menos 3 veces en comparación a ovocitos controles y un aumento de conductancia de cuerda a 40 mV de 5,9 μS promedio. Además a 30 mV las corrientes exógenas disminuyeron en un 51,8% al agregar ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico (DIDS) y en un 52,8% al agregar ácido difenilamina-2-carboxílico (DPC), ambos conocidos bloqueadores de canales de Cl-. Estos datos demuestran la presencia vías conductivas para Cl- en la MB del sinciciotrofoblasto placentario humano / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1070695

Objetivos: El objeto de estudio es la membrana basal glomerular (M.B.G.) y la distribución de dos de las moléculas estructurales de las matrices extracelulares del corpúsculo renal, la fibronectina y la laminina. el estudio se ha realizado con cuatro especies aparentemente próximas de un mismo grupo zoológico (Rodentia) dado que experimentalmente, se incorporan nuevas especies como animales de laboratorio, comparando un animal estándar de laboratorio, con especies silvestres, con distintas estrategias tróficas.Material y métodos: Se han utilizado individuos adultos de Mus musculus (cepa isogénica BALB/c), y Mus spretus, Apodemus sylvaticus y Clethrionomys glareolus precedentes de capturas "in vivo" realizadas en el medio natural. El material histológico ha sido procesado mediante M.O. (tinción del PAS-Azul de Alcián/He. y dos técnicas de localización inmunohistoquímica, inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia para anticuerpos anti-fibronectina y anti-laminina) y mediante M.E.T. (estándar y de inmunolocalización de anticuerpos anti-fibronectina y anti-laminina mediante oro coloidal).Resultados: La M.E.T. no muestra diferencias morfológicas entre los glomérulos de las diferentes especies utilizadas, excepto para la M.B.G. ya que en todas las especies silvestres utilizadas, el material que conforma toda la M.B.G. aparece con densidad uniforme. Con la inmunolocalización mediante oro coloidal los resultados para la distribución de fibronectina en M. musculus muestran marcaje positivo en la matriz mesangial, y negativo en la M.B.G. y en la membrana basal peritubular. Los resultados para M. spretus y C. glareolus son semejantes a los obtenidos para M. musculus; si bien con un valor de reacción menor al observado para M. musculus.Con la inmunolocalización mediante oro coloidal los resultados para la distribución de laminina, en M. musculus muestran marcaje positivo en la matriz mesangial, en la membrana basal tubular y en la M.B.G., en ésta última con tendencia a localizarse en las dos láminas raras. Los resultados para M. spretus y C. glareolus son semejantes a los obtenidos para M. musculus aunque con un valor de reacción menor al observado para el ratón de laboratorio.Las muestras procedentes de A. sylvaticus, no mostraron reactividad positiva frente a ninguno de los dos anticuerpos, anti-fibronectina y anti-laminina, utilizados.Conclusiones: La ultraestructura trilaminar de la M.B.G. presente en M. musculus no se observa en las otras especies utilizadas; en éstas existe densidad prácticamente uniforme en todo su espesor: Tampoco existe diferencia en el límite entre la M.B.G. pericapilar, la M.B.G. perimesangial y la matriz mesangial.En las especies M. musculus, M. spretus y C. glareolus la fibronectina se localiza única y exclusivamente en la matriz mesangial y en ningún caso en las M.B.G. mientras que la laminina se localiza tanto en las M.B.G. como en la cápsula de Bowman, la membrana basal tubular y la matriz mesangial. Mostrando en la M.B.G. pericapilar una ligera tendencia a localizarse en las láminas raras externa e interna.El marcaje menos intenso en M. spretus y C. glareolus y su ausencia en A. sylvaticus para la fibronectina y la laminina en la M.B.G. y la matriz mesangial puede indicar un carácter de divergencia filogenética.ENGLISH / DISTRIBUTION OF FIBRONECTIN AND LAMININ IN RENAL CORPUSCLE OF DIVERSE SPECIES OF RODENTSPropose: The aim of this study is the glomerular basement membrane (GBM) and the distribution of two of structural molecules of the extracellular matrices of the renal corpuscle: fibronectin and laminin. The study has been performed with four apparently closed species of a same zoological group (Rodentia) since experimentally, new species like laboratory animals are starting being breeded, comparing a standard laboratory animal with wild species with different trophic strategies.Material and methods: Adults exemplars of Mus musculus (isogenic strain BALB/c), Mus spretus, Apodemus sylvaticus and Clethrionomys glareolus proceeding of captures "in vivo" made in natural fields have been used. The histological material has been processed by means of OM (stain PAS-Alcian Blue/H) and two immunohistochemical techniques, immunoperoxidase and immunofluorescence for antibodies anti-fibronectin and anti-laminin and by TEM (standard and immunolocalization of antibodies anti-fibronectin and anti-laminin by colloidal gold).Results: TEM does not show morphological differences between the glomeruli of the different species used, except for the GBM , showing the material that conforms all the GBM a uniform density in all the wild species. With the immunolocalization by colloidal gold, the results for the distribution of fibronectin in M. musculus is positive in the mesangial matrix, and negative in the GBM and the peritubular basement membrane. The results for M. spretus and C. Glareolus are similar to obtained for M. musculus; although with a smaller reaction to that observed for M. musculus. With the immunolocalization by colloidal gold the results for the distribution of laminin, in M. musculus is positive in the mesangial matrix, the tubular basement membrane and the GBM; the latter with tendency to be located in two laminae rara. The results for M. spretus and C. glareolus are similar to obtained for M. musculus although with a smaller reaction to the observed for the laboratory mouse.The samples from A. sylvaticus, did not show positive reactivity again the anti-fibronectin and anti-laminin antibodies used.Conclusions: The trilaminar ultrastructure of the GBM presents in M. musculus is not observed in the other species used; in those a uniform density in all its thickness exists. Differences in the limit among the pericapillary GBM, the perimesangial GBM and the mesangial matrix does not exist either. In M. musculus, M. spretus and C. glareolus species fibronectin are exclusively located in the mesangial matrix and never in the GBM, whereas laminin is located mainly in the GBM and also in the Bowman's capsule, the tubular basement membrane and the mesangial matrix; showing in the pericapillary GBM a slight tendency to be located in external and internal laminae rara. The less intense labelling in M. spretus and C. glareolus and its absence in A. sylvaticus for fibronectin and laminin in the GBM and the mesangial matrix may suggest a philogenetic divergence.

A sinalização da matriz extracelular (MEC) é essencial para a determinação do destino e comportamento de células epiteliais da glândula mamária. Entretanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares envolvidos nesse processo. A via Hippo, uma cascata de sinalização que participa da regulação de diversos comportamentos celulares, incluindo o tamanho de órgãos, parece ser uma importante candidata a mediadora sinalização da MEC. Resultados preliminares do laboratório indicam que a arquitetura tecidual e a membrana basal, componente da MEC de epitélios e outros tecidos, influenciam a localização, concentração e atividade de YAP, uma proteína efetora da via Hippo, em células epiteliais mamárias. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi identificar as proteínas que interagem com Yap (ortólogo de YAP em camundongo) nas células epiteliais da glândula mamária em resposta à membrana basal. Foram utilizadas células EpH4, uma linhagem mamária não-tumoral murina, como modelo de diferenciação funcional e formação de ácinos em um ensaio de cultura tridimensional (3D). O tratamento de estruturas multicelulares 3D pré-formadas em placas nãoadesiva com uma matriz rica em laminina (lrECM) alterou a localização e o padrão subcelular de Yap, assim como a expressão gênica de membros da via Hippo e dos alvos de Yap, mas não alterou a expressão das proteínas da via em nível de proteína. O ensaio de co-imunoprecipitação (CoIP) seguida de análise por espectrometria de massas identificou um conjunto diferencial de proteínas que interagem com Yap na fração citoplasmática de células EpH4 cultivadas na ausência ou na presença de lrECM em um modelo de ECM-overlay. Uma análise realizada junto à database KEGG Pathways revelou que os possíveis interagentes Yap nas células cultivadas não-tratadas com lrECM participam de processos relacionados à proteólise mediada por ubiquitina, enquanto nas células expostas à lrECM os possíveis interagentes estão associados a processos metabólicos e são especialmente proteínas-chave do metabolismo de lipídios. A busca na plataforma de redes de interação STRING não identificou trabalhos que destaquem a interação de Yap com estas proteínas. A plataforma Vizit indica a participação de Yap em processos relacionados à síntese e atividade de lipídios e hormônios, o que reforça as evidências de que está pode ser uma nova função de Yap ainda não explorada em detalhes. A fim de se obter resultados complementares à CoIP, padronizamos o ensaio de identificação por biotinilação dependente de proximidade (BioID) em células embrionárias de rim humano da linhagem 293FT. As proteínas isoladas por pulldown foram identificadas por espectrometria de massas e uma análise junto à database Gene Ontology indicou que os possíveis interagentes de Yap nestas células são em sua maioria proteínas relacionadas à via Hippo, o que reforça a robustez do ensaio. Nós pretendemos transpor este sistema para as células EpH4. A expectativa é que, em conjunto, estes resultados nos orientem em projetos futuros para compreender os mecanismos de sinalização da MEC na morfogênese e diferenciação da glândula mamária. / Extracellular matrix (ECM)-signaling is crucial for determination of epithelial cell fate and behavior in the mammary gland. However, little is known about the molecular mechanisms involved in these processes. The Hippo pathway, a signaling cascade involved in the regulation of several cellular processes, including organ size, seems to be an important candidate as a mediator of this signaling. Our preliminary results indicate that the tissue architecture and the basement membrane, an ECM component of epithelia and other tissues, influence the location, level and activity of YAP, an effector of the Hippo pathway. In this context, the goal of this work was to identify the proteins that interact with Yap (ortholog of YAP in mouse) in mammary epithelial cells in response to the basement membrane. We used EpH4 cells, a nontumoral murine mammary cell, in a functional differentiation and acini-forming in tridimensional (3D) culture assay. Treatment of 3D multicellular structures pre-formed on nonadhesive plates with a laminin-rich extracellular matrix (lrECM) altered the subcellular localization and pattern of Yap, as well as gene expression of Hippo pathway proteins and Yap targets, but did not altered the expression of the pathway members at the protein level. Coimmunoprecipitation (CoIP) followed by mass spectrometry analysis identified a differential set of proteins interacting with Yap in cytoplasmic fractions of EpH4 cells in the absence or presence of lrECM in an ECM-overlay culture model. An analysis performed with the KEGG Pathways database revealed that putative Yap interactors in non-treated cells participate in processes related to ubiquitin-mediated proteolysis, whereas in cells exposed to lrECM Yap interactors are associated to metabolic processes and are mainly key-proteins of metabolism of lipids and carbohydrates. A search in interaction networks platform STRING did not identify previous works that showing the interaction of Yap with these proteins. Vizit platform indicated the participation of Yap in processes related to the synthesis and activity of lipids and hormones, which reinforces the evidences that Yap can play a novel poorly explored role. To obtain complementary results to CoIP, we devised the proximity-dependent biotinylation identification (BioID) assay on embryonic renal cells of 293FT cell line. Pulldown-isolated proteins were identified by mass spectrometry and an analysis performed with Gene Ontology database revealed that putative Yap interactors are Hippo pathway-related proteins, which reinforces the robustness of the assay. We intend to transpose this system to the EpH4 cells. We expect that, together, these results will guide us in future projects to understand the signaling mechanisms of ECM in mammary gland morphogenesis and differentiation.

O presente estudo foi realizado para esclarecer o surgimento de vesículas subepidérmicas em enxertos de pele comumente descritos como áreas enxertadas. Devido à discrepância existente entre a literatura, que afirma surgirem vesículas nessas áreas, e a nossa experiência clínica, onde não observamos tal fato, decidimos investigar o problema. Para isso, estudamos a transição dermoepidérmica (TDE), em 23 pacientes submetidos à enxertia de pele, para verificar se há ou não alteração dessa estrutura que pudesse justificar a formação de vesículas. Nos 23 pacientes estudados foram feitas duas biópsias: a primeira, imediatamente antes da excisão do enxerto, na área doadora - pele sã, considerada como amostra padrão normal da TDE - Amostra Padrão AD. Após 10 dias, realizou-se uma segunda biópsia, com o mesmo vazador, próxima à área da primeira biópsia - Amostra Teste - ENX. Cada amostra foi dividida em 2 partes iguais (46 amostras) e estudadas por microscopia de luz e por imunofluorescência direta (imunomapeamento), pesquisando-se a possível alteração da zona da membrana basal (ZMB) na TDE através dos antígenos penfigóide bolhoso, laminina, colágeno IV e colágeno VII. Na microscopia de luz estudou-se, em cada biópsia, a relação entre a medida linear do relevo da trasição dermoepidérmica e a medida linear do relevo da superfície da camada granulosa, logo abaixo da camada córnea, equivalente a medida linear da superfície da pele. Nas 46 amostras as análises por microscopia de luz e de imunomapeamento para os quatro antígenos evidenciou-se a manutenção do mesmo padrão morfológico. Não houve diferença no imunomapeamento. Observou-se relações lineares das medidas com médias de 1,17 para a amostra AD e 1,44 para a amostra ENX, diferença que foi estatisticamente significativa, porém conservando a manutenção do padrão da TDE em relação à pele normal. Foi observada a manutenção do padrão do relevo da TDE no enxerto, em relação à pele sã, doadora. / SUMMARY: The present study has been done to elucidate the onset of subepidermal blisters in skin grafts, usually mistaken as grafted sites. Due to the discrepancy between literature - assigning this onset of blisters in grafts and our experience opposite we have decided to carry out this study. To do so we have studied the dermal-epidermal junction in 23 burned patients who underwent skin grafting so that we could verify whether or not there could be any alteration in the dermal-epidermal junction structure that may explain this fact. Among the 23 studied patients, two biopsies were carried out: the first one just before harvesting the skin graft from donor site healthy skin. The so called sample was regarded as an ordinary standard one of the dermal-epidermal junction STANDARD SAMPLE - DS. After graft take, by ten days, a second biopsy was performed with the same punch, close to the first biopsy TEST SAMPLE GS. Both samples were split into two equal parts (46 samples) and studied using light microscopy and direct immunofluorescence (immune mapping), searching for possible alterations in basement membrane zone in the dermal-epidermal junction through bullous pemphigoid, laminin and types IV and VII collagen antigens. On light microscopy, relation between the linear measure of dermal-epidermal junction projection and that of stratum granulosum surface, just underneath the stratum corneum, corresponding to skin surface, was studied in each biopsy. The four analyses of the antigens by light microscopy and direct immunofluorescence in the 46 samples clearly showed the keeping of the same pattern, either for STANDARD SAMPLE DS or TEST SAMPLE GS. There were no differences on the immune mapping. Regarding the relation of the linear measures it was noted a mean of 1.17 for STANDARD SAMPLE DS and a mean of 1.44 for TEST SAMPLE GS. Such difference was statistically significant. Nevertheless, it maintained the keeping of the same pattern of dermal-epidermal junction when compared to healthy skin.