Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, Laboratório de Bioquímica e Química de Proteínas, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-10-30T12:35:16Z
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2013_RaynerMyrLauterjungQueiroz.pdf: 2749536 bytes, checksum: 919b0cd19524ed0a125aae72c5a61ed3 (MD5) / O Trypanosoma cruzi é o protozoário causador da doença de Chagas, uma enfermidade que afeta milhões de pessoas especialmente na América latina onde é endêmica. O parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro dos seus hospedeiros mamíferos e triatomíneos. A respeito
especialmente do hospedeiro mamífero, os tripomastigotas, a forma sanguínea infectiva
do T. cruzi, diferencia-se intracelularmente em amastigotas replicativos após um
período de incubação dentro de fagolisossomos ácidos, em um processo denominado amastigogênese. Aqui buscamos encontrar novas informações concernentes a esse processo através da análise do subproteoma de superfície celular dos estágios de vida presentes no homem e do repertório protéico secretado/excretado por tripomastigotas em pH fisiológico e também nas primeiras 3 horas de amastigogênese axênica. Também realizamos uma análise quantitativa do proteoma total e do fosfoproteoma durante a amastigogênese. Todos os subproteomas foram aqui analisados por LC-MS/MS com um espectrômetro de massas Orbitrap Velos. Primeiro utilizamos epimastigotas, o estágio do parasito encontrado no inseto vetor, para padronizar e avaliar o enriquecimento de proteínas da superfície celular por duas técnicas distintas: uma baseada na tripsinização
da superfície de células intactas e a outra baseada na biotinilação de proteínas expostas
na superfície e seu enriquecimento por cromatografia de afinidade a estreptoavidina. Os resultados mostraram que essas abordagens ofereceram informações abrangentes e complementares sobre o subproteoma da membrana plasmática do parasito e, então, foram aplicadas na análise desse subproteoma nas formas amastigota e tripomastigota. A análise quantitativa do proteoma e fosfoproteoma usou parasitos diferenciados de forma axênica em quatro pontos do processo (0 min, 30 min, 2 h e 9 h) e os fosfopeptídeos foram enriquecidos com resina de TiO2. Finalmente, o secretoma de tripomastigotas foi obtido de uma maneira similar ao protocolo de aquisição de antígenos secretados/excretados, mas com cuidados adicionais para evitarmos lise mecânica das células. As análises renderam milhares de proteínas identificadas que eram comprovadamente ou preditas como associadas à membrana plasmática ou secretadas e são envolvidas na interação parasito-hospedeiro. Da mesma forma, várias proteínas e fosfopeptídeos relevantes possuíram expressão regulada durante a amastigogênese. / Trypanosoma cruzi is a protozoan that causes Chagas' disease, a neglected infectious illness that affects millions of people, mostly in the Latin America. The parasite undergoes several differentiation processes in order to adapt to different conditions inside both mammalian and triatomine hosts. Specially regarding mammalian hosts, the trypomastigote, an infective bloodstream life-form of the T. cruzi, differentiates intracellularly to the replicative amastigote stage after a period of incubation inside acidic phagolisossomes, in a process called amastigogenesis. Here we aim to bring further light to this process by analysing the cell surface subproteome of the mammalian hosted life-forms of the parasite and the secreted/excreted protein repertoire from trypomastigotes in physiological pH and also at the first 3 hours of the acidic pH induced amastigogenesis. Finally, we performed the quantitative proteome and phosphoproteome analysis of the amastigogenesis by iTRAQ labeling. All T. cruzi subproteomes were analysed by LC-MS/MS with Orbitrap Velos mass spectrometer. First we used T. cruzi epimastigotes, the insect hosted life-form, in order to prepare samples enriched in cell surface proteins by two distinct methodologies, which were optimized and evaluated. The first methodology was based on cell surface trypsinization (Shave) of intact living cells while the second approach used biotinylation of cell surface proteins followed by streptavidin affinity chromatography isolation of the labeled proteins. The results showed that the methodologies offered comprehensive and complementary information about the parasite's plasma membrane subproteome, which were applied afterwards in the trypomastigote and amastigote cells. The quantitative proteome and phosphoproteome analysis used the axenicaly differentiated parasites in four time points (0 min, 30 min, 2 h and 9 h) and the phosphopeptides were enriched using TiO2 beads. Finally, the trypomastigote secretome were obtained in a similar way to the protocols of acquisition of secreted/excreted antigens, but with further care to avoid mechanical lysis. The results yielded thousands of protein identifications which were either proved or expected to be associated to the plasma membrane or secreted and are involved in host-parasite interection and, in the same way, we found several proteins and phosphopeptides that have regulated expression during amastigogenesis.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/14455 |
| Date | 03 1900 |
| Creators | Queiroz, Rayner Myr Lauterjung |
| Contributors | Charneau, Sébastien Olivier, Ricart, Carlos André Ornelas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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