Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Ruthléa Nascimento (ruthlea@bce.unb.br) on 2008-10-30T14:27:19Z
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2008_AnaMariaCosta.pdf: 3885912 bytes, checksum: e120b16f41fa85a75f30e9c489b804ab (MD5) / A integração de minicírculos de kDNA do Trypanossoma cruzi no genoma hospedeiro foi
correlacionada com alterações na expressão gênica. Com a finalidade de caracterizar as regiões híbridas e
ampliar o conhecimento biológico realizou-se os isolamentos e clonagens dos minicírculos integrados no
genoma de macrófagos humanos em cultura e de tecidos de coelhos chagásicos. Observou-se
instabilidade genética dos segmentos que continham as integrações. As clonagens realizadas em
diferentes combinações de vetores e hospedeiras não evitaram os rearranjos. A análise de restrição e o
seqüenciamento dos segmentos recuperados mostraram alterações no tamanho e na estrutura do vetor. A
técnica de captura desenvolvida no presente estudo permitiu confirmar a instabilidade genética dos
minicírculos preferencialmente integrados. A análise de restrição e o seqüenciamento desses fragmentos
mostraram que os minicírculos recuperados apresentaram encurtamentos nas regiões variáveis em relação
ao padrão descrito na literatura. Verificou-se que o encurtamento ocorreu durante ou após a integração no
genoma. As regiões variáveis encurtadas de 50 pb foram recuperadas das linhagens subclonais de
macrófago A11, C4, C6 e coração de coelhos chagásicos. Quando comparadas entre si essas regiões
apresentaram similaridade na ordem de 90%. Em relação à região variável 80 pb, recuperada do
macrófago C6, a similaridade foi em torno de 75%. O resultado sugeriu a existência de classes de
minicírculos que se integram preferencialmente no genoma hospedeiro. Foram obtidos clones híbridos
estáveis contendo o final da região conservada nas extremidades seguidas pela região variável truncada,
fragmento de elemento LINE-1, com ou sem a presença de microssatélite. A origem híbrida foi
confirmada por fragmentação do clone que foi utilizado como sonda na hibridação de macrófagos
humanos normais e DNA de T. cruzi. O segmento B7, obtido por captura, apresentou o minicírculo de
kDNA com 4 regiões variáveis truncadas, intercaladas por regiões conservadas normais seguidas do
microssatélite CA e da região humana com similaridade ao clone murino AC131797.3. A análise “in
silico” do segmento B7 mostrou a presença de seqüências regulatórias da expressão gênica. Foram
identificadas 9 possíveis ORFs, sendo duas compreendo a região híbrida (ORF1 e 2). Verificou-se nas
integrações recuperadas de coração de coelhos chagásicos segmentos similares à região humana
encontrada no clone B7, indicando a recorrência dos sítios recombinativos. A análise “in silico” do clone
B7, G10 e das regiões hospedeiras obtidas dos bancos de dados mostrou a presença de estruturas do tipo
não B nos locais próximos ao ponto de recombinação. A presença da estrutura não B no segmento B7 foi
confirmada pela alteração na mobilidade eletroforética. Em todos os pontos de entrada do minicírculo no
genoma hospedeiro verificou-se a redução da tensão local e aumento da tensão global na região,
sugerindo a possibilidade de ocorrência de novos eventos recombinativos envolvendo o segmento. O
conjunto das informações indica que a integração é mediada por recombinação homologa mediada por
similaridades estruturais presentes no DNA hospedeiro e minicírculo de kDNA. / The integration of Trypanossoma cruzi kDNA minicircle sequences into the host cell’
genomemay result in alterations of genic expression. To achieve the characterization of the hybrid regions
and enhancement of the biological knowledge the isolation and cloning of the integrated minicircles was
made in vitro in the human macrophages and in the chagasic rabbit tissues. Genetic instability of the
segments with the integrations was observed. The cloning made it in different combinations of vectors
and hosts did not avoid deletion and rearrange. The capture technique developed in the present study
showed kDNA integration events with the genetic instability. The sequencing of the kDNA integrated
events and restriction analysis revealed that the minicircle sequences were frequently rearranged; short
minicircle variable regions fragments were constantly found in relationship to the standard size describe
in literature. Possibily, deletions of integrated sequences took place during or after the kDNA integration
into the macrophage genome. Short variable regions (50 pb) was recovered from macrophages cell lines
A11, C4, C6 and from chagasic rabbits. Those integrated kDNA minicircles shared 90% sequences
similarities. The variable region stretches also revealed 75% similarities among them. These results
suggest that classes of minicircles integrate preferentially in the macrophage genome. Somewhat stable
hybrid clones were found with the final conserved region followed by a fragment of the variable region
linked to the LINE-1 sequence, with or without the presence of microsatellites. The hybrid origin of these
sequences was demonstrated by hybridization experiments with segment specific chimera sequence
fragments. A capture procedure revealed a B7 fragment showing the kDNA minicircle with 4 truncated
variable regions interspersed by CA microsatellite with similarity to the AC131797.3 murine clone. The
“in silico” analysis of the B7 fragment showed the presence of genic expression regulatory sequences in
the minicircle region. The identification of nine putative ORFs within hybrid regions (ORFs 1 and 2) was
recorded. The kDNA integration events detected into the heart DNA from chagasic rabbits showed
similar host regions to that of clone B7 clone, indicating that homologous recombination was the
mechanism whereby the kDNA integrated into the vertebrate genome. The presence of B structures in the
DNA sequences at the integration sites has suggested that bends formed in those sites explains the
alterations in the eletrophoretic mobility presented in those clones. At the integration sites in the host
genome bents formed by reduced tension forces forming torsion angles, thus indicating the possibility of
new integration events, deletions and recombinations at the spot. These findings showing sequences
similarities present in the host DNA and kDNA minicircle sequences have suggested that the kDNA
integration might be mediated by homologous recombination.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/1376 |
| Date | 06 1900 |
| Creators | Costa, Ana Maria |
| Contributors | Santana, Jaime Martins de, Teixeira, Antônio Raimundo Lima Cruz |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | Free, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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