Os efeitos de preparações de plasma rico em plaquetas (PRP) sobre a atividade osteogênica in vitro e in vivo em contato com biomateriais são divergentes na literatura. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão e/ou atividade de marcadores iniciais da diferenciação osteoblástica em culturas de células osteogênicas crescidas sobre titânio (Ti) e expostas a coquetel de fatores de crescimento e proteínas PRP-símile (coquetel de FCs). Células osteoblásticas primárias derivadas de calvárias de ratos recém-nascidos foram cultivadas em meio osteogênico e expostas, nos 7 primeiros dias, a coquetel de FCs nas diluições 1:1 (FCs), 1:10 (FCs/10), 1:100 (FCs/100) e 1:1000 (FCs/1000). Foram avaliados, nos tempos de 7, 10 e 14 dias: 1) os aspectos morfológicos e a imunomarcação de sialoproteína óssea (BSP) e osteopontina (OPN), por epifluorescência; 2) a proliferação celular, por ensaio de MTT; 3) a expressão de RNAm para o fator de transcrição Runx2, BSP e fosfatase alcalina (ALP), por PCR em tempo real; 4) a atividade de ALP, clivada da fração de membrana; 5) quantificação da mineralização, por extração do vermelho de Alizarina. Os resultados mostraram inibição da formação dos nódulos de matriz mineralizada em culturas FCs e atraso em seu desenvolvimento em FCs/10 e FCs/100, em comparação a FCs/1000 e controle. A expressão de Runx2, BSP e ALP era menor em todas as culturas expostas ao coquetel de FCs em 7 dias, sendo que para Runx2 e BSP notava-se o efeito concentração-dependente em 10 dias. Menores valores de atividade de ALP foram observados nas culturas FCs e FCs/10, com efeito concentração-dependente e correlação positiva com a mineralização em 7 dias, mas não em 10 e 14. Os resultados permitem concluir que a exposição ao coquetel de FCs inibe e/ou atrasa a diferenciação osteogênica de culturas primárias sobre Ti. Adicionalmente, a atividade de ALP de membrana pode ser considerada também um marcador inicial de diferenciação osteoblástica, indicativo do potencial osteogênico no modelo in vitro utilizado. / The effects of platelet-rich plasma (PRP) preparations on the in vitro and in vivo osteogenic activity in contact with biomaterials have been subject of debate and controversy in the literature. The aim of the present study was to evaluate the expression and/or activity of early markers of osteoblast differentiation in cultured osteogenic cells grown on titanium (Ti) and exposed to a PRP-like cocktail of growth factors and proteins (GFs cocktail). Primary osteoblastic cells derived from newborn rat calvarial bone were cultured in an osteogenic medium (control group) and exposed during the first 7 days of culture to the following dilutions of GFs cocktail: 1:1 (GFs), 1:10 (GFs/10), 1:100 (GFs/100) and 1:1000 (GFs/1000). At days 7, 10 and 14 of culture, the following parameters were assessed: 1) morphology and immunolabeling for bone sialoprotein (BSP) and osteopontin (OPN) by epifluorescence microscopy; 2) cell proliferation by MTT assay; 3) mRNA expression for the osteoblast markers Runx2, BSP and alkaline phosphatase (ALP) by real time PCR; 4) ALP activity following ALP cleavage from cell membrane; 5) mineralization by Alizarin red extraction. The results showed no mineralized nodules for the GFs group and a delayed nodule formation for GFs/10 and GFs/100 compared with GFs/1000 and control. Whereas Runx2, BSP and ALP mRNA levels were lower for all cultures exposed to the GFs cocktail at day 7, a concentration-dependent effect was noticed only for Runx2 and BSP at day 10. The GFs cocktail showed a concentration-dependent effect on ALP activity, with the lowest values for GFs and GFs/10 cultures and a positive correlation with mineralization at day 7 but not at day 10 or 14. In conclusion, inhibited and/or delayed osteogenic differentiation take place in primary cultures grown on Ti and exposed to the GFs cocktail. In addition, membrane ALP activity can also be considered an early marker of osteoblast differentiation, indicative of the in vitro osteogenic potential in the model used.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04022015-081521 |
| Date | 24 July 2014 |
| Creators | Soares, Mariana Sales de Melo |
| Contributors | Oliveira, Paulo Tambasco de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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