Metodologias de sequenciamento do genoma total para investigação de diferentes tipos de câncer detectaram recentemente uma nova classe de alterações caóticas de DNA, denominada Chromothripsis. Este fenômeno de instabilidade genômica é relativamente comum em tumores de Osteossarcoma (OS), mas existem poucos estudos que expliquem esta conexão ou abordem suas causas e consequências. A presente tese iniciou-se com a re-análise de microarrays de dez amostras de OS pediátrico, previamente processadas pelo nosso laboratório, para avaliar a variação de número de cópias de DNA (CNVs). Usando ferramentas de detecção de padrões característicos de Chromothripsis (CTLPs), encontramos 3 amostras de OS com Chromothripsis , que afetaram quatro cromossomos (2, 10, 14 e 20). As amostras com presença de Chromothripsis tiveram uma media de 468 CNVs/amostra, enquanto o grupo sem o fenômeno teve uma média de 255 CNVs/amostra. Após essa avaliação de CNVs, comparamos os níveis de expressão de RNA entre duas amostras com a presença e quatro tumores com ausência de Chromothripsis. Cerca de 171 genes estão presentes em regiões de CNVs diferentes entre os grupos avaliados. Destes, a maioria (77 genes) são relacionados com funções de comunicação celular e ao ciclo celular. Um grupo de 43 genes foi relacionado às vias de processo metabólico (principalmente associado ao metabolismo do RNA) e 27 genes associados à organização do componente celular ou biogênese. Tumores com Chromothripsis possuiam 4 genes do sistema imune menos expressos (CADM1; CLEC4A; CCR1; CD164) e 12 estavam superexpressos (IL32, LAT, BCL3, FCAR, RFX1, ILIB, CXCL1, SPON2, CCR6, IL6, SEMA3C, GEM). Os genes pouco expressos também têm um papel na via de adesão celular. A adesão celular está associada à progressão do câncer e metástase. Em seguida, re-analisamos as CNVs de 82 amostras de OS e 35 linhagens celulares de OS, usando microarrays disponíveis em bancos de dados públicos (GEO e arrayexpress), para identificar potenciais regiões cromossômicas comumente envolvidas em alterações caóticas no número de cópias de DNA, especialmente CTLPs. Identificamos Chromothripsis em 27 amostras (11 tumores e 16 linhagens), afetando 17 cromossomos diferentes. Os cromossomos 2, 8 e 12 foram alvos frequentes de Chromothripsis em OS. Em seguida, foram analisados dados de sequenciamento WGS de 12 tumores de OS disponíveis no banco de dados online dbGaP. Fizemos a avaliação da variação de número de cópias para caracterizar detalhadamente as alterações caóticas e identificar asregiões cromossômicas alvo envolvidas nas regiões de alterações caóticas no número de cópias do DNA. Encontramos CTPLs em 7 (58%) das 12 amostras de OS analisadas, usando dados de sequenciamento total. Foram encontrados 12 cromossomos diferentes afetados pelo fenômeno de alteração caótica. CTPLs foram detectadas em 62,5% das amostras de pacientes que faleceram em decorrência deste tumor. Os cromossomos 1, 3 e 7 foram um pouco mais afetados por Chromothripsis nas amostras disponibilizadas pelo dbGaP. Além disso, os cromossomos 2 e 12 também foram afetados por Chromothripsis nessas amostras. Cerca de 700 genes/tumor foram encontrados nas regiões de CTLPs. Um total de 101 genes foram localizados em regiões de alteração de número de cópias que distinguem os grupos com e sem Chromothripsis. Estes genes estão relacionados com vias de processo celular (45 genes - os quais 17 estão associados à comunicação celular) e processo metabólico (22 genes - os quais 19 estão associados ao processo metabólico primário). Nós também comparamos os níveis de expressão gênica das amostras disponíbilizadas pelo dbGap, em que foram avaliados dados de expressão de 6 amostras de RNA de OS com Chromothripsis e de 3 amostras de RNA de OS sem Chromothripsis . Diferentes algoritmos e ferramentas foram utilizadas para avaliação de RNA. Nós analisamos os dados de expressão por dois diferentes mecanismos: EdgeR e Nexus Expression. Ambos mostraram menor expressão de RNA nas vias de comunicação celular e processo metabólico primário em amostras com Chromothripsis. Os genes com regulação negativa da resposta do sistema imunológico foram encontrados em ambas ferramentas (COL8A1, CCL25). Para estudar os cromossomos envolvidos na formação de micronúcleos na linhagem celular U2OS, foram investigados erros na divisão celular induzidos por drogas (durante a anáfase). Esta etapa foi realizada durante o período de doutorado sanduíche, no Barts Cancer Institute, em Londres-UK. Os cromossomos com erros durante a anáfase foram contados por meio da técnica de FISH centromérica. Os cromossomos mais comumente encontrados com erros foram Chr2, Chr6, Chr11 e Chr12. Estes dados corroboram a ideia de que alguns cromossomos são mais suscetíveis a erros de divisão celular e colaboram para maiores índices de CTPLs em certos tumores. O fenômeno Chromothripsis parece estar presente em pelo menos 30% dos tumores de osteossarcoma e pode estar contribuindo para o fenótipo mais agressivo deste tumor ósseo. / Whole genome sequencing methods applied to a number of human cancers have detected a new class of chaotic DNA alterations in tumors called Chromothripsis. This mechanism of genomic instability is relatively common in the human bone tumor osteosarcoma (OS), but there are few studies in this tumor addressing either its causes or consequences. In this thesis we initially re-analyzed the DNA copy number data using newer software designed to detect signatures of Chromothripsis-like Patterns (CTLPs) using ten OS samples previously studied by our laboratory. We found three of the osteosarcomas had Chromothripsis signatures that affected four chromosomes (2, 10, 14 and 20). The osteosarcomas with Chromothripsis had a median of 468 copy number abnormalities per tumor compared to 255 for OS tumors without Chromothripsis. Next, we compared global RNA expression levels from two OS samples with Chromothripsis to four tumors without Chromothripsis to determine the types of gene expression differences associated with this process. We found that 171 genes mapped to regions of Chromothripsis with the majority (77 genes) mainly having functions related to cellular communication and cell cycle. There were 43 genes that were related to metabolic process (mainly associated with RNA metabolism) and 27 genes with cellular component organization or biogenesis. Also, there were four genes associated with the immune system that were underexpressed (CADM1; CLEC4A; CCR1; CD164) and 12 were overexpressed (IL32, LAT, BCL3, FCAR, RFX1, ILIB, CXCL1, SPON2, CCR6, IL6, SEMA3C, GEM) in the Chromothripsis tumors. Interestingly, all the genes underexpressed also have a role in cell adhesion pathway. Cell adhesion is associated with cancer progression and metastasis. We then reanalyzed DNA copy number data from 82 OS tumors and 35 OS cell lines using microarrays datasets available in public databanks (GEO and arrayexpress), to identify potential chromosomal regions commonly involved in chaotic DNA copy number alterations, especially CTLPs. We found Chromothripsis in 27 OS samples (11 tumors and 16 cell lines), affecting 17 different chromosomes. Chromosomes 2, 8 and 12 were frequent targets of Chromothripsis in OS. Sequentially, the DNA copy number alterations were analyzed using whole genome sequence data of 12 OS tumors available from dbGaP databank to characterize chaotic alterations in detail and identify the target chromosomal regions involved in Chromothripsis. We found Chromothripsis patterns in 7 (58%) of the 12 OS samples analyzed using whole genome sequence data. In total there were12 different chromosomes involved affecting 62.5% of samples from patients that died from OS. Chromosomes 1, 2, 3, 7 and 12 were slightly more often Chromothripsis target locations. Nearly 700 genes per tumor were found in the CTLPs regions. A total of 101 genes were located in regions of copy number change that distinguished the group of OS with Chromothripsis in comparison to OS without Chromothripsis. These genes are related with cellular process (45 genes - which 17 are associated with cell communication) and metabolic process (22 genes - which 19 are associated with primary metabolic process). We were also able to compare the RNA levels from the dbGap samples when expression data was available: comparing 6 OS RNA samples with Chromothripsis to 3 OS RNA samples without Chromothripsis. Both the EdgeR and Nexus Expression pipelines showed downregulation in cell communication pathway and primary metabolic process in samples with Chromothripsis. Genes downregulated of immune system response pathway were found in both pipeline (COL8A1, CCL25). To study the chromosomes involved in micronucleus formation in the OS cell line U2OS, errors in cell division induced by drugs during the anaphase were evaluated during the sandwich period at Barts Cancer Institute in London-UK. The lagging chromosomes were counted and the most common chromosomes with errors were Chr2, Chr6, Chr11, and Chr12. These data provide further support to the idea that some chromosomes are more susceptible to cell division errors and corroborate with the chromosomes affected by CTPLs in some tumors.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-19022019-110314 |
| Date | 26 June 2014 |
| Creators | Gomes, Alexandra Galvão |
| Contributors | Martelli, Lucia Regina |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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