Após setenta anos de sua descoberta, o vírus da zika surgiu no Brasil, espalhou-se rapidamente pelas Américas e trouxe complicações incomuns em doenças causadas por Flavivirus, como a microcefalia. A Organização Mundial da Saúde classifica a zika como a doença viral mais preocupante da atualidade e considera urgente desenvolver novos métodos de diagnóstico para ela e doenças correlatas como a dengue. Embora existam exames para identificar infecções pelos vírus dessas duas doenças, ainda não há um método rápido, específico e de baixo custo para o diagnóstico precoce. Visando preencher essa lacuna, este trabalho teve como objetivo construir dois tipos de biossensores eletroquímicos de DNA para detecção label-free desses dois vírus. Foram fabricados eletrodos descartáveis em substrato de politereftalato de etileno metalizado com filme fino de ouro nas configurações com um e três contatos. As sequências genéticas de iniciadores e sondas de captura foram desenhadas especialmente para este trabalho com base na análise dos genomas dos vírus. O primeiro biossensor utilizou o eletrodo em uma célula eletroquímica e foi capaz de identificar sequências de DNA da zika ou da dengue. As análises por espectroscopia de impedância eletroquímica mostraram que o biossensor é seletivo à sequência alvo com limite de detecção de (9,86 ± 0,89) nmol L-1. O segundo biossensor utilizou um eletrodo de três contatos para identificação de sequências de DNA em uma gota da amostra. No contato central, usado como eletrodo de trabalho, foi imobilizada a sequência de captura e os contatos laterais funcionaram como eletrodos de referência e auxiliar. Nesse sistema as medidas de impedância indicaram limite de detecção de (25,0 ± 1,7) nmol L-1. Os biossensores desenvolvidos mostraram seletividade para identificar o material genético dos vírus da zika e da dengue nos ensaios com DNA sintético e, portanto, são promissores para a análise de amostras reais, principalmente de produtos da polimerase da cadeia reversa. / After seventy years of its discovery, zika virus has emerged in Brazil, spread rapidly throughout the Americas, bringing unusual complications in diseases caused by flaviviruses, such as microcephaly. The World Health Organization classifies zika as the most harmful viral disease today and considers urgent the development of new diagnostic methods for zika and related diseases, such as dengue. Although there are tests to identify both infections, no current diagnostic method is rapid, specific and cost-efective. This thesis describes two types of electrochemical DNA biosensors for label-free detection of these zika and dengue. Disposable electrodes were fabricated on polyethylene terephthalate substrates covered with a nanometric gold layer by thermal evaporation, manufactured in one- and three-contact configurations. Genetic sequences of primers and complementary capture probes were designed based on the analysis of the virus genomes. The first biosensor we developed used the new electrode in an electrochemical cell and was able to identify zika or dengue DNA sequences. Analyses by electrochemical impedance spectroscopy showed that these biosensors are selective for zika or dengue with a detection limit of (9.86 ± 0.89) nmol L-1. A second type of biosensor used a three-contact electrode to identify DNA sequences in a drop of sample. In the central contact, used as a working electrode, the capture sequence was immobilized and the lateral contacts acted as reference and auxiliary electrodes. In this system the impedance measurements indicated a limit of detection of (25.0 ± 1.7) nmol L-1. The developed biosensors showed selectivity for zika and dengue in the synthetic DNA assays, and therefore are promising for the analysis of real samples, especially the polymerase chain reaction amplicon.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-05052017-094358 |
| Date | 09 March 2017 |
| Creators | Faria, Henrique Antonio Mendonça |
| Contributors | Zucolotto, Valtencir |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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