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Isaac Queiroz de Oliveira.... Triagem dos antígenos ... 2013. pdf.pdf: 1026269 bytes, checksum: bfd51de16e1f840140bd71f78f00b22d (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T18:40:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Isaac Queiroz de Oliveira.... Triagem dos antígenos ... 2013. pdf.pdf: 1026269 bytes, checksum: bfd51de16e1f840140bd71f78f00b22d (MD5)
Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / As leishmanioses são antropozoonoses causadas por diferentes protozoários do
gênero Leishmania. Estima-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em
áreas de risco, com uma incidência anual de aproximadamente dois milhões de
novos casos no mundo. O cão é o principal reservatório dos centros urbanos e o
flebótomo é o vetor responsável por sua transmissão. No Brasil, de acordo com as
recomendações do Ministério da Saúde, cães soropositivos para leishmaniose
devem ser sacrificado. O diagnóstico recomendado pelo Ministério da Saúde é feito
com o teste rápido DPP-LVC® para triagem e o ELISA para confirmação. Trabalhos
demonstram que o DPP-LVC® não é capaz de detectar uma parcela da população
de cães, o que pode contribuir para a perpetuação da doença nestas áreas. Doze
proteínas recombinantes (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11,
Lci12, Lci13) foram clonadas e sequenciadas em um estudo anterior, porém não
foram completamente caracterizadas quanto à antigenicidade. Nossa hipótese é que
um conjunto de antígenos selecionados a partir dessas proteínas recombinantes de
L. infantum poderá ampliar a identificação de animais infectados em áreas
endêmicas. O objetivo deste estudo foi identificar um conjunto de antígenos
recombinantes de L. infantum, a partir de 12 antígenos previamente selecionados,
quanto ao reconhecimento por soros de cães infectados para futuramente compor
um teste imunodiagnóstico para leishmaniose visceral canina. No presente estudo,
os 12 antígenos recombinantes previamente selecionados foram produzidos em
nosso laboratório e purificados em Bio-Manguinhos. O ensaio de MAPIA (Multi-
Antigen Print ImmunoAssay), que consiste em uma plataforma de triagem de
antígenos em papel de nitrocelulose, mais próxima do teste rápido DPP-LVC®, foi
utilizado para avaliação do reconhecimento dos 12 antígenos recombinantes por
soros de cães infectados. Na triagem foram utilizados soros caninos positivos para
leishmaniose visceral (n = 39), obtidos em estudo epidemiológico de corte
transversal em área endêmica. Para avaliação da reatividade cruzada foram
utilizados soros de cães com outras patologias: leishmaniose tegumentar (n = 10),
tripanossomíase canina (n = 10), babesiose (n = 10) e erliquiose (n = 11), além de
soros de animais negativos (n = 40). Inicialmente, foi definido o melhor protocolo
para ser utilizado nos ensaios de MAPIA. Posteriormente, a triagem dos antígenos
foi realizada com os soros e, para avaliar, a confiabilidade dos resultados obtidos, os
testes foram lidos por dois observadores de maneira independente. A concordância
entre as leituras visuais dos dois observadores foi avaliada utilizando o índice
Kappa. O teste exato de Fisher foi empregado para avaliar diferenças estatísticas
entre o índice de positividade das proteínas avaliadas. As proteínas Lci1A e Lci2B
foram reconhecidas por 74% e 69%, respectivamente. As Lci4, Lci5 e Lci12
obtiveram reconhecimento de 33%, 31% e 33%, respectivamente pelos anticorpos
presentes nos soros. Baixa reatividade dos soros de cães com babesiose, erliquiose,
tripanossomíase canina foi observada com as 12 proteínas recombinantes
avaliadas. Soros de cães com leishmaniose tegumentar foram os que apresentaram
mais reatividade com as proteínas recombinantes. Analises combinatórias foram
realizadas para identificar a partir dos 12 antígenos previamente selecionados, o
conjunto destes capaz de identificar o maior número de soros de cães com
leishmaniose visceral canina testados. Foram identificadas duas combinações
compostas por cinco antígenos, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 e Lci1A, Lci2B, Lci8,
Lci12, Lci5. Quando comparado o reconhecimento desses conjuntos com a
combinação de Lci1A e Lci2B foi observado um aumento de 77% para 87%, no
entanto não foi observada diferença estatística (p= 0,098) apesar desse incremento.
Esse achado aponta para possibilidade de avaliar os dois conjuntos em um teste
imunocromatográfico no formato do teste final (DPP). Em resumo, utilizando o teste
de triagem MAPIA foi possível selecionar dois conjuntos de cinco proteínas
recombinantes de L. infantum que mostraram potencial para compor um teste
imunodiagnóstico no formato DPP multi-antígenos. / Leishmaniasis is an antropozoonosis caused by different protozoa of the
genus Leishmania. It is estimated that approximately 350 million of people are at risk
areas, with annual incidence of approximately two million new cases worldwide. The
dog is the main reservoir in urban centers and the sandfly is the vector responsible
for transmission. In Brazil, according to the recommendations of the Ministry of
Health, seropositive dogs for leishmaniasis should be euthanized. The diagnosis is
made by the DPP-LVC® as screening and ELISA as confirmatory. Studies have
shown that DPP-LVC® is not able to detect a portion of the dog population, which
may contribute to the perpetuation of the disease in these areas. Twelve recombinant
proteins (Lci1A, Lci2B, Lci3, Lci4, Lci5, Lci6, Lci7, Lci8, Lci10, Lci11, Lci12, Lci13)
were cloned and sequenced in a previous study, but were not fully characterized for
antigenicity. Our hypothesis is that a set of selected recombinant antigens of L.
infantum may increase the identification of infected animals in endemic areas. The
aim of this study was identify a set of recombinant antigens of L. infantum from 12
previously selected for recognition by sera from infected dogs to compose an
immunodiagnostic test for canine visceral leishmaniasis. The 12 recombinant
antigens were produced in our laboratory and purified in Bio-Manguinhos. MAPIA
(Multi-Antigen Print ImmunoAssay), which consists in a screening platform for
antigen in nitrocellulose paper, was used to assess the recognition of recombinant
antigens for 12 sera of dogs infected. MAPIA is closer to rapid test DPP-CVL® than
other screening tests. We used this screening method with sera positive for canine
visceral leishmaniasis (n = 39) obtained in a cross-sectional epidemiological study in
endemic area. For evaluation of cross-reactivity, sera from dogs with other diseases:
cutaneous leishmaniasis (n = 10), canine trypanosomiasis (n = 10) babesiosis (n =
10) and ehrlichiosis (n = 11), and animal sera negative (n = 40) were used. Initially,
was decided that the best protocol to be used in the assays. Subsequently, screening
of antigens was performed with sera and to evaluate the reliability of the results, the
tests were read by two observers independently. The agreement between visual
readings of the two observers was assessed using the kappa index. The Fisher exact
test was used to evaluate statistical differences between the positivity rate of the
proteins studied. The proteins Lci1A and Lci2B were recognized by 74% and 69%,
respectively. Lci4 (33%), Lci5 (31%) and Lci12 (33%) achieved a good degree of
recognition by antibodies present in serum. We observed low reactivity of sera from
dogs with babesiosis, ehrlichiosis, and canine trypanosomiasis with the 12
recombinant proteins. Sera from dogs with cutaneous leishmaniasis were most likely
reacted with the recombinant proteins. Combinatorial analyzes were performed to
identify a set of antigens from the 12 previously selected, that can identify the larger
number of sera from dogs with canine visceral leishmaniasis. We identified two
combinations composed of five antigens, Lci1A, Lci2B, Lci8, Lci12, Lci4 and Lci1A,
Lci2B, Lci8, Lci12, Lci5 that were most recognized by serums. When compared
recognition of combination of Lci1A + Lci2B and two sets of 5 proteins, sensitivity
increased from 77% to 87%, however this increase was not statistically different (p =
0.098). Despite this finding did not reach statistical significance, points us to evaluate
the possibility of two sets in an immunoassay format of the final test (DPP). In
summary, using MAPIA, two sets of five recombinant proteins of L. infantum showed
potential to be used in immunodiagnostic test in multi-antigens DPP.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7315 |
| Date | January 2013 |
| Creators | Oliveira, Isaac Queiroz de |
| Contributors | Fraga, Deborah Bittencourt Mothé, Medeiros, Marco Alberto, Ribeiro, Guilherme de Sousa, Moreira Júnior, Edson Duarte, Veras, Patrícia Sampaio Tavares |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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